Harpin蛋白编码基因在转基因油菜后代中的遗传表达以及对农艺性状的影响

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Harpins是一类由革兰氏阴性植物病原细菌产生的非寄主专化性激发子,可以激发烟草的过敏反应(Hypersensitive Response,HR),诱导植物产生抗病性、抗虫性并可以促进植物生长。Hapins类激发子都具有相似的生化特征:富含甘氨酸(Gly),不含半胱氨酸(Cys),热稳定,对蛋白酶敏感。经Harpin蛋白处理,植物可以对真菌、细菌、害虫等多种病原物产生抗性。将编码Harpin蛋白的基因转入水稻、烟草、马铃薯等植物中,能提高转基因植株的抗病水平。
   hrf2基因来源于水稻细条斑病菌Xanthomonas oryzae pv.oryzicola菌株RS105,该基因共414 bp,其产物HarpinXooc(HpaG)含138个氨基酸,分子量约为15.3KD。HarpinXooc蛋白具有与其他Harpins蛋白类似的特征和功能,能够诱导植物产生抗病性、抗虫性并促进植物生长。本研究旨在将编码HarpinXooc的基因hrf2转化油菜,以期获得抗病性提高和性状优良的转基因油菜,为新品系的培育奠定基础。
   本实验通过农杆菌介导法将含有hrf2基因的植物表达载体pCAMBIA1301::hrf2介导转化甘蓝型油菜扬油4号,经GUS染色和PCR检测,共筛选了16株抗性再生植株(T0代)。自花授粉得到的种子在田间种植作为T1代,GUS组织化学染色分析结果表明:外源基因在后代中的分离情况符合孟德尔单基因3:1分离定律。对T1代GUS染色呈阳性的植株进行PCR检测、Southern blot检测、RT-PCR检测,结果证明,hrf2基因已整合到油菜基因组中并能在转录水平正常表达。株系T1-1中,外源基因的拷贝数为1。为了鉴定转基因植株的抗病性,对PCR阳性植株进行离体叶片抗菌核病实验结果表明:株系T1-1、T1-2、T1-3、T1-4、T1-5的病斑直径显著小于对照,最小的只有1.6 cm,与对照相比,减小32.4%。
   我们选择T1代中PCR结果呈阳性且抗病性提高的32棵植株自花授粉,收获的种子第二年在田间种植作为T2代。PCR结果表明,有78%的植株能扩增出约414 bp的特异性条带,经测序,与hrf2基因一致性为100%。离体叶片抗病性结果表明:32个株系中,62.5%的转基因株系病斑显著小于对照,其中45%的株系在0.01的水平病斑显著小于对照,抗病性显著提高。
   田间条件下,转基因植株的生长健康,发育正常,转基因植株的部分农艺性状发生变异,但T1、T2代植株的农艺性状表现稳定。转基因植株开花期延迟,与未转化植株相比,开花期均延迟约7~10天。多数转基因植株茎基部较粗,每荚粒数均少于对照,但是千粒重有所增加。T1、T2代中茎基部直径最大达到2.53及3.07cm,分别比对照增加38.5%与61.5%。单株产量在两代中最大分别为96.11 g与94.75 g,比对照分别增重22.7%与12.2%。由此,我们认为,通过基因工程方法培育具有抗病性且农艺性状优良的油菜新品种是一种可行的有效地策略。
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