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研究背景随着全球老龄化进程的加快,骨质疏松带来的骨折及社会、家庭负担逐渐加重。此外,严重的创伤性骨折、肿瘤切除、先天性疾病会导致巨大的节段性骨缺损,给临床工作带来很多困难。生长因子(growthfactors)、多肽(peptides)及小分子(smallmolecules)联合人造骨移植材料(Syntheticbonegraftsubstitutes)可以明显诱导成骨细胞的转移、分化和成熟。研究表明超过2cm的骨折后缺损就需要生物活性因子的介入,否则将难以愈合。因此,生长因子、多肽及小分子正成为国内外研究骨折缺损修复的热点。神经肽Y(neuropeptideY,NPY)是位于大脑和周围神经系统的重要神经递质。NPY具有促进骨折愈合、改善膝关节骨性关节炎、治疗骨质疏松脆性骨折的多重作用,是一种重要的骨骼神经营养因子。NPY在周围组织骨细胞、成骨细胞、破骨细胞中可通过直接和间接激活多个通路来促进骨合成及代谢。NPY可能会参与增强成骨细胞介导的骨合成、抑制破骨细胞介导的骨吸收,是骨折愈合的关键因子。此外,NPY对关节软骨修复、维护骨代谢均衡也具有关键的作用。研究表明,关节滑膜、关节软骨、半月板和软骨下骨等关节组织都含有丰富的神经肽。NPY是重要的交感神经肽,其对髋、膝等关节的神经滋养作用正受到越来越多的关注,并被认为是改善骨性关节炎(osteoarthritis,OA)的潜在治疗靶点。同时,NPY是治疗绝经后骨质疏松症(Postmenopausalosteoporosis,PMO)的重要神经营养因子。在人体及啮齿类动物模型中,NPY通过NPYY1受体(NPYreceptorY1,NPY1R)和NPYY2受体(NPYreceptorY2,NPY2R)调节体内骨量平衡。NPY沉默的小鼠在面对冷刺激时表现为体内皮质酮水平升高,骨量丢失,其骨丢失速度是野生型小鼠的3倍;其分子生物学机制是沉默NPY的小鼠体内中枢和外周组织缺乏NPY,不能通过其相应的NPY2R受体抑制皮质酮的产生,继而对抗应激反应造成的骨量丢失。换言之,NPY具有在应激状态下促进体内骨合成的作用。然而,NPY通过什么信号通路调控骨折后骨代谢及骨形成,仍有待于进一步研究。综上所述,探究NPY与机体成骨的相应分子生物学机制,对改善骨折后巨大骨缺损的预后具有重要意义及研究价值。本研究体内实验中,通过建立C57BL/6小鼠胫骨骨折模型,探究了NPY及成骨相关基因在骨折初期的细胞分布及表达情况,揭示出NPY可参与骨折早期炎症反应,可能起到骨诱导的作用;在体外实验中,我们合成了NPY小干扰RNA(siRNA)及NPY过表达质粒,并将其转染入小鼠前成骨MC3T3-E1细胞,进一步检测了MC3T3-E1细胞成骨相关基因和蛋白的表达情况,揭示了NPY基因通过上调Runx2、Osterix基因表达促进细胞成骨的分子生物学机制。第一部分神经肽Y在小鼠骨折愈合中的作用及相关机制研究研究目的:1.检测小鼠胫骨闭合骨折愈合过程中NPY在小鼠血清中的表达情况。2.检测小鼠骨折组织愈合过程中成骨相关因子NPY,NPY1R,Runx2,OsterixmRNA及蛋白表达情况。3.分析NPY在小鼠骨折愈合中的生物学效应。研究方法:1.建立C57BL/6小鼠的闭合胫骨骨折模型以18只SPF级C57BL/6雄性小鼠为实验对象,在异氟醚诱导麻醉下人工掰断一侧胫骨建立小鼠胫骨闭合骨折模型,密切监测小鼠饮食及饮水情况。2.动态观察小鼠骨折过程中骨痂形成、重塑分别于建模后第0、1、7、14天,随机取3只小鼠,进行IVIS(?)SpectrumCT检测,观察骨折部位骨痂形成情况。3.检测小鼠骨折愈合过程中血清NPY的表达情况分别于建模后第1、7、14天,随机取出3只小鼠,取血后,采用酶联免疫吸附测定法(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)检验C57BL/6小鼠血清中NPY的表达水平。4.检测小鼠骨折愈合过程中成骨相关基因及蛋白的表达分别于建模后第1、7、14天,随机取出3只小鼠处死,并取骨折处组织提取RNA,应用RT-PCR技术检测组织样本中NPY,NPY1R,Runx2,OsterixmRNA的表达。取上述小鼠骨折处组织,切片石蜡包埋,行苏木精/伊红染色(hematoxylin-eosinstaining,HE)或固定在70%乙醇中分别行NPY,NPY1R,Runx2,Osterix的免疫组织化学染色(Immunohistochemicalstaining,IHC)。利用AI图像分析系统(Alpathwell)自动读取石蜡切片免疫染色区域图像,分析测定阳性染色的灰度值。研究结果:1.成功建立了C57BL/6小鼠胫骨闭合骨折模型通过大体观察小鼠生活状态,术后第1天,小鼠运动较少,可能小鼠患处有轻微疼痛,但不影响进食和饮水。术后第2天,小鼠可逐渐活动。术后2周,小鼠患肢即可负重行走,有时可见双侧肢体同时站立的情况。提示患肢术后2周有足够强度及硬度支撑体重。2.宏观及微观角度观察动物模型中骨折愈合良好从宏观角度,我们应用IVIS(?)SpectrumCT三维成像系统动态观测小鼠骨折愈合情况。CT显示术后14天骨折线模糊不清,骨折端骨性骨痂形成,提示建模成功。从微观角度我们应用HE染色,观察建模第14天骨折处出现初级骨化中心,并可见新生骨小梁结构,骨性骨痂形成提示建模成功。3.动物模型中血清NPY表达情况应用ELISA法检测了小鼠骨折后14天细胞外血清中NPY的表达情况。NPY不同时间点(建模后第1、7、14天)浓度范围为925.35pg/ml-1055.2pg/ml。NPY浓度在检测的14天的时间段内有一过性下降后逐渐增高趋势,但整体差异无明显统计学意义(P=0.152)。4.小鼠骨折愈合过程中成骨相关基因及蛋白表达情况应用RT-PCR法检测了小鼠骨折愈合过程中成骨相关基因mRNA表达情况,结果显示:NPYmRNA在骨折早期纤维性骨痂组织中高表达,在软骨痂中中等表达,在骨痂中低表达。建模后第7、14天NPYmRNA的表达量分别是第1天的27%和9%,差异具有统计学意义(P