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目的：掌握表皮干细胞的体外分离、培养及鉴定方法，观察神经肽CGRP对表皮干细胞增殖的调节及对表皮干细胞Wnt/β-catenin信号通路β-catenin、c-myc基因表达水平影响。
方法：①采用胰蛋白酶和胰蛋白酶-EDTA两步法分离出角质形成细胞，用Ⅳ型胶原快速粘附法富集分离表皮干细胞并体外培养，以角质形成细胞为对照组。观察人表皮干细胞的细胞形态和一般生长状态，比较人表皮干细胞和角质形成细胞的克隆形成率；同时采用免疫荧光细胞化学染色法检测β1整合素表达，流式细胞术分析细胞周期，鉴定表皮干细胞。②将富集分离出的人表皮干细胞分成实验组和对照组，实验组中加入神经肽CGRP(10-mol/L)，分别以MTT、BrdU掺入法检测神经肽CGRP对表皮干细胞体外增殖的影响及流式细胞术检测神经肽CGRP对细胞周期的影响。③Real time PCR法检测神经肽CGRP对表皮干细胞Wnt/β-catenin信号通路β-catenin、c-myc基因表达水平变化的调节。
结果：①Ⅳ型胶原包被的培养瓶、皿中快速贴壁细胞继续培养可见细胞克隆数逐渐增多，两周左右可见大克隆形成。与角质形成细胞相比，表皮干细胞有更强的克隆形成能力，两者的克隆形成率分别为18.32±1.03％和8.56±0.94％，二者相比有统计学差异(P<0.05)；人表皮干细胞β1整合素免疫荧光细胞化学染色呈阳性。②流式细胞周期分析显示，富集分离的表皮干细胞GO/G1期的细胞比例为97.09％；加入神经肽CGRP组细胞DNA合成进入S期占22.4±6.3％，而对照组细胞S期占：16.1±2.9％，二者相比有统计学差异(P<0.05)；MTF检测显示神经肽CGRP可促进细胞增殖(24h OD值：CGRP组：0.260+0.066，对照组：0.201+0.022;48h OD值：CGRP组：0.817±0.063，对照组：0.709±0.076)；差异均具有统计学意义，(P<0.05)； BrdU掺入法示BrdU阳性细胞数为神经肽CGRP组：140.8±28.8/每高倍视野，高于对照组102.0±15.8/每高倍视野(P<0.05)。③Real time PCR法检测显示加入神经肽CGRP后，表皮干细胞Wnt/β-catenin信号通路β-catenin、c-myc基因表达水平上调。
结论：①本实验利用表皮干细胞对IV型胶原的快速粘附特性，获得较为纯化的表皮干细胞，并用细胞免疫荧光化学染色法和流式细胞仪鉴定并分析了这些表皮干细胞的生物学特性及细胞周期。②神经肽CGRP可促进体外培养表皮，干细胞的增殖，并可上调表皮干细胞β-catenin、c-myc基因表达水平，提示Wnt/β-catenin信号通路在此过程中可能发挥一定的作用。本研究结果为进一步研究表皮干细胞体外培养、增殖、分化的调控奠定基础。