目的： 探索和建立一套简便、经济而有效的脆性X综合征基因筛查方法,并在不明原因精神发育迟滞人群中探讨脆性X综合征的临床和分子遗传学特征。 背景介绍： 脆性X综合征(Fragile X syndrome:FXS)具有独特的遗传方式,约98％的患者是由FMR1基因的动态突变引起的。该动态突变系定位在FMR1基因5非翻译区(5-UTR)的三核苷酸(CGG)n重复序列在家系传递过程中不稳定扩增所致。自FMR1基因被定位以来,这种传递给下一代的不稳定扩增的分子遗传学基础已经逐渐被阐明：从前突变到全突变几乎都发生在母亲传递给其孩子时,而且随着前突变等位基因(CGG)n重复数的增加,这种突变风险也随之增加。而父源性传递则总是保持在前突变范围内。 鉴于脆性X综合征相对较高的前突变和全突变的发病率,且目前尚缺乏有效的治疗手段,在临床上能够发现这些脆性X位点的携带者,进行优生优育显得尤为重要。理论上,可通过发现FMR1基因的动态突变来筛查病人,从而发现这些潜在的受累家庭。然而由于普通的PCR筛查技术难以扩增出较大前突变和全突变的等位基因,所获得的为阴性结果,故难以排除实验自身条件的限制；诸多现有的PCR改进方案,虽然较前能够获得更多的EGG重复数,但亦伴随高昂的实验费用,在大规模的人群筛查中并不可行,导致以往的研究主要集中于具有高风险的人群,例如不明原因精神发育迟滞或类孤独症等。随着基因检测技术的不断进步,探索和建立一套省时、经济的筛查方法逐渐成为研究的热点问题之一。 [ 研究对象和方法：共收集不明原因精神发育迟滞或者具有其他FXS特殊体征的病人99例,其中男性71例,女性28例,大多数患者年龄均在16岁以下。收集临床资料,并进行智力水平评估,收集病人外周血标本,酚/氯仿法抽提基因组DNA。 单管平衡半巢式PCR：应用单管平衡半巢式PCR扩增包含(CGG)n重复在内的目的片段,小于600 bp的扩增片段视为正常大小的等位基因,大于600 bp的片段可以视为前突变等位基因,同时扩增一约223 bp左右的片段作为内对照。对于全突变等位基因,PCR方法不能扩增,因此未获得大小约500～600bp的目的片段,考虑为可疑的全突变携带者。 Southern blot：应用EcoRI/EagI双酶切基因组DNA约10μg,以1.0％的琼脂糖凝胶电泳,经变性、中和并转移到尼龙膜上,以地高辛标记(Roche)的非放射性StB12.3探针进行杂交,以碱性磷酸酯酶标记的抗地高辛抗体进行免疫结合,并用NBT/BCIP化学显色法显色。 结果： 1、99例入选对象基因组DNA,经单管平衡半巢式PCR扩增,其中98例均可以获得包含(CGG)n重复在内的正常大小的等位基因和内对照片段,而仅有内对照片段扩增的一例男性,大小约500～600bp(对应约15到45个CGG重复)的目的片段却未能扩增,提示为一前突变或全突变患者。其母亲单管平衡半巢式PCR未发现异常。 2.进一步经Southern blot分析,该患者被证实为全突变患者,其母亲为一前突变嵌合体携带者。 3、在81例智力低下患者中(男性58例),筛查倒1例FXS患者。故总智力低下人群和男性智力低下人群中,FXS的患病百分比分别为1.2％和1.7％。 结论： 单管平衡半巢式PCR能快速检测FMR1的正常基因型,并克服了常规PCR筛查病人时阴性结果的限制,具有快速、安全、经济、实用等优点,适用于FXS人群筛查。 Southern blot能够诊断全部前突变和全突变等位基因及嵌合体患者,同时可了解甲基化状态,是FXS最可靠的诊断方法。 在本研究总智力低下人群和男性智力低下人群中,FXS的患病百分比分别为1.2％和1.7％,与国外报道的筛查结果相一致。