细胞是生物体结构和功能的基本单位，是生命的基本单元。细胞是由非常复杂的动态分子网络如蛋白、核酸和脂类等构成的，每一个生物大分子均可看做纳米尺度的分子机器，具有其独特的行为特征和功能特征如能量代谢、物质运输、信号转导和基因调控等。因此，在单细胞单分子水平下研究活细胞内生物大分子的定位、动力学过程以及分子间的相互作用等具有重要的意义。传统的生物化学技术主要基于细胞裂解液以及总体平均的研究方法，不能揭示很多重要的生命过程的发生机制。而活细胞单分子荧光成像技术的发展，可以在尽可能不干扰细胞活性的情况下提供高时空分辨率的生物分子的定位以及动力学的实时定量的信息，单分子水平下研究生物分子的作用机制成为可能。　　转化生长因子TGF-β/Smad信号转导通路在细胞的组织器官发育、细胞增殖、分化、运动以及凋亡等过程中具有非常重要的调节作用。而TGF-β信号通路的紊乱则与肿瘤的发生发展、组织的纤维化以及心血管疾病等密切相关。而TGF-β信号通路下游蛋白Smad3以及Smad7的上膜激活能够调控TGF-β通路的信号传导过程。因此，在活细胞单分子水平研究TGF-β信号通路下游蛋白在细胞膜上的运动以及调控机制具有重要的意义。　　本论文采用全内反射荧光成像技术，建立并发展单分子追踪以及统计方法，通过表征TGF-β信号通路下游蛋白Smad3以及Smad7在细胞膜区的停留以及运动的动态过程，在单分子水平上研究了Smad3和Smad7的细胞膜区激活机制。主要研究内容如下:　　1.活细胞膜表面单分子追踪算法的比较与优化。在得到生物分子在一段时间内的多帧荧光图像之后，我们需要对其进行准确的定位以及精确的追踪。虽然目前有不少的开放源代码的单分子追踪程序可供使用，但是针对不同的研究对象，如何选择合适的追踪程序至关重要。本章以玻璃片上固定的荧光分子作为研究对象，对两种自动化的单分子追踪程序进行评估和比较，通过对其参数的选择和优化使其适用于活细胞单分子图像的追踪。此外我们将优化好的程序用于TβRⅡ扩散运动的研究，验证了活细胞实验中追踪程序的可靠性，并在之后的实验中将该程序用于追踪Smad蛋白的动态上膜过程。　　2.研究了Smad3的上膜及其在细胞膜区域的激活机制。Smad3在转化生长因子TGF-β信号由细胞膜到细胞核的转导过程中发挥着非常重要的作用。由于Smad3激活的瞬时性和非同步性，通过传统的生物学方法很难了解其激活过程，因此对Smad3的激活机制一直存在着较大的争议。通过对上膜的EGFP-Smad3分子进行活细胞单分子荧光成像，我们实时地观察到在TGF-β信号通路中单个Smad3分子上膜激活的动态行为。通过定量地表征Smad3在膜上的扩散速度和停留时间，我们提出了Smad3在细胞膜区的激活模型:在无配体刺激时，Smad3在细胞质和细胞膜之间进行穿梭，并且可以在细胞膜上与TGF-β1型受体结合。当TGF-β1刺激之后Smad3和激活的受体复合物结合，在细胞膜上被磷酸化。Smad3的磷酸化过程导致Smad3在膜上有较长的停留时间，而Smad3与受体复合物的结合则导致Smad3在膜上有较慢的扩散速度。Smad3的上膜以及膜上磷酸化过程，不受内吞的影响。　　3.研究了Smad7的上膜及其抑制信号的机制。Smad7在TGF-β信号通路相关的疾病的发生与发展中有着非常重要的作用。利用传统的生物化学方法，如免疫共沉淀和免疫荧光的方法研究Smad7对TGF-β信号的抑制作用，难以观测Smad7在细胞膜上的动态过程和抑制信号的调控机制。通过对细胞膜区的EGFP-Smad7进行活细胞单分子荧光成像，我们实时地观察到在TGF-β信号通路中单个Smad7分子上膜的动态行为。我们发现无论有无TGF-β1刺激Smad7都会上膜，并且Smad7在膜上表现出两种不同的扩散速度与解离速率，这表明刺激前后Smad7在细胞膜区域有两种不同的结合状态。我们发现Smad7的MH2domain对Smad7的解离过程非常关键，并且发现富含Caveolin-1的lipid raft区域对Smad7的上膜发挥着重要的调控作用，据此，我们提出Smad7在细胞膜区抑制TGF-β1信号的机制。