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L-半乳糖内酯脱氢酶(L-galactono-1,4-lactone dehydrogenase,简称GLDH)直接氧化L-半乳糖内酯生成抗坏血酸(AsA),GLDH位于植物细胞的线粒体内膜上,是植物AsA生物合成途径中最后一步的关键酶.作为植物组织内广泛存在的高丰度小分子物质,AsA对于植物自身的抗氧化作用、光合保护以及调节生长发育等都具有非常重要的生理功能.通过调控GLDH基因的表达,可望改变GLDH的活性,从而调控抗坏血酸代谢,增加植物对逆境的抗性,为研究植物抗逆机理提供新的切入点。本研究利用超表达技术和RNA干涉技术来调控水稻GLDH基因的表达,以期从分子水平深入探讨GLDH的生理功能,主要结果如下:
1.超表达载体和干涉载体的构建及其转化
经生物信息学分析,可知GLDH基因在水稻基因组中共有2个相似序列,分别位于第11和第12号染色体上.通过特异引物选取合适片段构建了二个GLDH超表达和一个干涉载体并转化水稻愈伤,经筛选、分化后获得转基因植株.
2.转基因植株的筛选与鉴定
以测定水稻叶片抗坏血酸含量为筛选指标,对转基因T0代植株进行筛选,结果表明超表达植株有2个株系AsA含量上调30-40％左右,干涉植株也有2个株系下调80％左右,均达到理想的效果.所得到三个载体的转化苗经PCR.检测均能扩出相应大小的片断.HPT基因的Southern杂交检测证明得到的转化苗均为阳性转基因植株.GLDH干涉植株的半定量RT-PCR结果表明,干涉植株GLDH的mRNA水平达到了理想的干涉效果,说明干涉植株GLDH的mRNA水平的下降是导致植株抗坏血酸含量减少的直接原因,以GLDH为关键酶的L-半乳糖途径可能是水稻中抗坏血酸的主要合成途径.
3.水稻抗坏血酸与草酸积累的关系
水稻材料在含NO3--N的营养液中培养3d后,取样测定叶片抗坏血酸和对应的草酸含量。结果表明:与野生型植株相比,尽管转基因植株叶片的AsA含量发生了显著变化(最高上调达40％,最高下调达80％),但相应的叶片草酸含量却没有明显差异.相关分析结果显示水稻叶片抗坏血酸含量变化与草酸积累之间没有相关性,说明水稻中草酸的积累调控并不依赖于抗坏血酸,抗坏血酸不是水稻中草酸合成的主要前体.
4.抗坏血酸含量变化对水稻耐盐性的影响及可能机理
以转基因杂合子植株为材料,先通过AsA含量检测确定转基因植株的上调和下调比例,然后选取上调约30％的超表达植株和下调约75％的干涉植株进行盐胁迫处理,结果表明;100mM NaCl处理下,超表达和野生型植株的生长状况相近,而干涉植株的生长受到较大影响,相应地超表达和野生型植株叶片的Na＋和K＋含量相近,而干涉植株叶片的Na＋含量高于超表达和野生型,约为野生型的1.9倍,说明干涉植株的耐盐能力下降,表明由GLDH基因的干涉所引起的AsA含量的减少与植物的耐盐性密切相关.盐胁迫后,超表达、野生型和干涉植株叶片的AsA含量均下降到同一水平,总抗坏血酸的含量也降低,超表达和野生型植株处理后AsA/DHA比率降低,而干涉植株的.AsA/DHA比率升高.另外,转基因植株进行盐胁迫后,相关分析表明水稻植株叶片的DHA含量与相对电导率大小之间呈显著负相关.从处理前后AsA/DHA比率的变化以及DHA.与相对电导率之间的关系来看,DHA可能在水稻耐盐机制中起更关键的作用.