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研究背景阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种中枢神经系统退行性疾病,主要表现为进行性认知功能障碍。随着人口老龄化程度的加快,AD在全球的发病率将逐步提高,给家庭及社会带来了沉重的负担。虽在临床中尚能识别此类疾病,但AD的发病机制尚不明确,无有效的治疗措施。近年来研究结果显示胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)是认知功能下降的重要危险因素之一。较多研究证实胰岛素抵抗与AD发病密切相关,但其具体机制尚不十分清楚。因此,从分子水平上探讨胰岛素抵抗与AD的关系,对AD的防治具有重要的意义。体外实验研究发现胰岛素能通过调节淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)代谢,进而影响p-淀粉样蛋白(β-amyloid, Aβ)的生成。有文献报道胰岛素抵抗能导致Ap生成异常增多和Tau蛋白过度磷酸化,但对胰岛素抵抗状态下脑组织APP代谢β,γ-分泌酶(β,γ-secretase)与胰岛素降解酶(insulin degradation enzyme, IDE)表达的变化报道较少。目前改善胰岛素抵抗的主要措施有运动锻炼、饮食干预及胰岛素增敏剂。吡格列酮是一种新型的胰岛素增敏剂,属于噻唑烷二酮类药物,主要通过激活过氧化物酶体增殖物活化受体γ(peroxisome proliferator-activated, PPARγ)发挥作用。有研究报道PPARγ激动剂能改善AD患者的认知功能,提示从胰岛素抵抗的角度防治AD可以取得一定的疗效。目的本研究采用高果糖喂养Wistar大鼠建立胰岛素抵抗大鼠模型,观察胰岛素抵抗大鼠行为学、脑组织胆碱乙酰转移酶(ChAT)的活性及APP代谢、Aβ生成的变化；从分子生物水平上,探讨胰岛素抵抗对动物脑损伤的可能机制及其与APP代谢、Aβ生成的相关性,以及吡格列酮在胰岛素抵抗大鼠脑损伤中的干预效果。方法45只6-8周龄清洁级健康雄性Wistar大鼠(购于山东大学实验动物中心),体质量200-220g,适应性喂养1周,从中随机选取10只作为正常对照组(NC组),标准啮齿类动物饲料喂养,饮用自来水；其余35只按照标准啮齿类动物饲料喂养,给予10%果糖水制作胰岛素抵抗模型。4周后,根据胰岛素抵抗指数(insulin resistance index, IRI)将制作成功的胰岛素抵抗大鼠随机分为两组,即胰岛素抵抗组(IR组)和吡格列酮组(pioglitazone, PIO组)。吡格列酮的干预方法：胰岛素抵抗模型成功建立后,IR组与PIO组继续按照标准啮齿类动物饲料喂养,饮用10%果糖水直至实验结束。PIO组同时按照吡格列酮(10mg·kg-1·d-1)灌胃给药,而NC组与IR组灌服相应体积的生理盐水,共计12周。干预12周后,进行以下检测：1.测定各组大鼠体质量、空腹血糖、胰岛素水平,计算胰岛素抵抗指数；2.通过Morris水迷宫实验观察大鼠行为学的变化；3.化学比色法测定各组大鼠脑组织内胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase, ChAT)的活性；4.免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)法检测各组大鼠脑组织β-淀粉样蛋白(β-amyloid, Aβ42)的表达；5.免疫印迹法(western blot)检测各组大鼠脑组织内APP、β-分泌酶(β-secretase, BACE-1)、早老素-1(presenilin, PS-1)、胰岛素降解酶(insulin degradation enzyme, IDE)的表达。6.对脑组织切片进行尼氏染色,镜下观察各组大鼠脑组织神经元形态及尼氏体的改变。结果1.各组大鼠体质量、空腹血糖、胰岛素水平的比较吡格列酮干预第12周后,IR组和PIO组大鼠体质量、空腹血糖较NC组有增高趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)；IR组和PIO组大鼠胰岛素水平较NC组增高(P<0.01或P<0.05)；与IR组相比,PIO组大鼠胰岛素水平降低(P<0.01)。IR组与PIO组的胰岛素抵抗指数较NC组增高(P<0.01),与IR组相比,PIO组大鼠胰岛素抵抗指数下降(P<0.01)。2.各组大鼠Morris水迷宫实验成绩的比较IR组与PIO组大鼠逃避潜伏期较NC组延长(P<0.01或P<0.05),与IR组相比,PIO组大鼠逃避潜伏期明显缩短(P<0.01)。3.各组大鼠脑组织胆碱乙酰转移酶(ChAT)活性的比较与NC组相比,IR组与PIO组大鼠脑组织内ChAT活性明显降低,且差异有显著性(P<0.01)；PIO组较IR组大鼠脑组织内ChAT活性增强,其差异有统计学意义(P<0.05)。4.免疫组织化学法检测Aβ42蛋白表达NC组大鼠海马区细胞排列紧密,胞体小,镜下可见Aβ42在胞浆内表达,表达较弱；与NC组相比,IR组大鼠神经元细胞排列疏松,胞体较大,Aβ42表达呈强阳性(P<0.01)；PIO组大鼠神经元细胞较IR组排列较紧密,阳性表达减弱(P<0.01)。5.免疫印迹技术检测各组大鼠脑组织APP、BACE-1、PS-1及IDE蛋白表达(1)IR组和PIO组APP蛋白表达水平较NC组升高,蛋白表达相对系数分别为NC组的2.66倍、1.75倍；与IR组相比,PIO组APP蛋白表达水平下降34.23%,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)与NC组相比,IR组和PIO组BACE-1蛋白表达水平增高,其蛋白表达相对系数分别为NC组的2.41倍、1.61倍；PIO组蛋白表达较IR组下降22.22%,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)IR组和PIO组PS-1蛋白表达水平较NC组升高,分别为NC组2.11倍、1.61倍；与IR组相比,PIO组PS-1蛋白表达水平下降23.85%,差异有统计学意义(P<0.05)。(4)IR组和PIO组IDE蛋白表达水平较NC组降低,分别为NC组0.577倍、0.836倍,其差异有显著性(P<0.01)；与IR组相比,PIO组IDE蛋白表达水平升高44.93%,其差异有统计学意义(P<0.05)。6.各组大鼠神经元形态的改变尼氏染色：镜下可见NC组大鼠脑内神经元形态正常,胞核膜和核仁清晰；IR组大鼠额叶皮质、海马的细胞排列疏松,细胞间隙增大,细胞浆内Nissl体减少或消失。PIO组较IR组有所改善,神经元细胞排列较整齐、密集,胞浆中Nissl体较丰富。结论1.胰岛素抵抗大鼠脑神经细胞发生病理性损害,认知功能下降。与脑组织胆碱乙酰转移酶活性下降,乙酰胆碱合成减少有关。2.胰岛素抵抗大鼠脑组织内APP、BACE-1及PS-1蛋白表达增加,IDE蛋白表达下降,提示胰岛素抵抗通过上调β、γ分泌酶的活性,同时,抑制IDE的活性,使Aβ42在脑内积聚增加。提示胰岛素抵抗是AD发生病理改变重要因素之一。3.吡格列酮通过改善胰岛素抵抗,增加中枢ChAT活性,维持胆碱能神经功能,对胰岛素抵抗大鼠记忆减退具有改善作用。同时,吡格列酮通过对BACE-1、PS-1及IDE的作用,继而减少Ap在脑内聚积。提示吡格列酮可能是改善AD症状的主要手段之一。意义本课题通过运用免疫印迹技术、免疫组织化学技术、尼氏染色、化学比色法及Morris水迷宫实验等方法,观察吡格列酮干预前后胰岛素抵抗大鼠脑组织中Aβ42、APP、BACE-1、PS-1、IDE表达以及大鼠逃避潜伏期的变化,了解胰岛素抵抗在AD发生发展中的作用,为AD发病机制的研究和防治提供了必要的理论依据。