【摘 要】
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中枢神经变性疾病指中枢神经系统某些区域的神经元发生退行性变.退行性变与神经元凋亡密切相关,在老年性痴呆和帕金森氏病等疾病中起关键作用,因此凋亡的机制是解开这些老年病之谜的钥匙,也是研制治疗药物的根据.探讨中枢神经元凋亡机制需要一个可靠、有效、重复性高、易于操作的细胞模型.小脑颗粒神经元(CGNs)在哺乳动物脑中含量丰富.体外培养时,高钾(25mM KCl)培养基可维持其分化、成熟和存活,而去血清、
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中枢神经变性疾病指中枢神经系统某些区域的神经元发生退行性变.退行性变与神经元凋亡密切相关,在老年性痴呆和帕金森氏病等疾病中起关键作用,因此凋亡的机制是解开这些老年病之谜的钥匙,也是研制治疗药物的根据.探讨中枢神经元凋亡机制需要一个可靠、有效、重复性高、易于操作的细胞模型.小脑颗粒神经元(CGNs)在哺乳动物脑中含量丰富.体外培养时,高钾(25mM KCl)培养基可维持其分化、成熟和存活,而去血清、低钾(5mM KCl)培养基可诱导分化成熟的CGNs凋亡.CGNs来源丰富,体外培养纯度可达95％,已使用多年,技术成熟,结果可靠,所以此凋亡模型已成为研究神经元的一个最常见的模型,被广泛应用于中枢神经元凋亡机制的研究,以及防治与凋亡有关的神经系统疾病的新药开发中.该实验室首次从眼镜蛇毒中发现,其中一个酸性蛋白成分200 ng/ml与CGNs孵育16h,可抑制低钾引起的CGNs凋亡.此组分经连续柱层析分离提纯,用SDS-PAGE测出分子量为14 kDa,测N末端20位氨基酸序列发现与眼镜蛇毒磷脂酶A<,2>相同,鉴定为眼镜蛇毒磷脂酶A<,2>,pHstat滴定法测定其磷脂酶A<,2>活性为15.0±0.5 Unit/mg.用蛋白免疫印迹法(western Blotting)研究其保护CGNs的细胞内信号传导机制发现,其不通过ERKl/2、PI3K/Akt/FKHR、cAMP/PKA通路、钙通道和α非敏感性N受体这几条经典的神经营养因子信号传导通路起作用.磷脂酶A<,2>可通过两条途径发挥生物学活性:水解重要的磷脂,生成游离脂肪酸和溶血磷脂引起相应的药理效应,或通过与受体和结合位点结合介导其他功能.那究竟眼镜蛇毒磷脂酶A<,2>抑制低钾引起的CGNs凋亡是通过其磷脂酶A<,2>活性的水解产物,还是通过与受体和结合位点结合起作用?为回答此问题,于是改良眼镜蛇毒磷脂酶A<,2>分离纯化方法,分析其保护作用的量效曲线;研究眼镜蛇毒磷脂酶A<,2>在各脑区是否有特异性结合部位,对大脑皮层神经元是否有保护作用;探讨其他来源的磷脂酶A<,2>是否也有类似功能,分析它们保护作用的量效曲线;并进一步研究这种保护作用和磷脂酶A<,2>酶活性的关系.结论:1.中华眼镜蛇粗毒5g经CM-Sephadex C-50、DEAE-Sephadex A-50和Sephadex G-75连续柱层析分离,得到50 mg能抑制低钾引起的CGNs凋亡的纯化磷脂酶A<,2>组分.2.眼镜蛇毒磷脂酶A<,2>在1~400 ng/ml内浓度依赖地抑制低钾引起的CGNs凋亡.3.<125>I标记眼镜蛇毒磷脂酶A<,2>在大鼠脑内的结合部位密度从高到低分别是:基底核、脑干、大脑皮层、中脑、白质、小脑.4.100~800 ng/ml的眼镜蛇毒磷脂酶A<,2>不能抑制秋水仙碱诱导的大鼠皮层神经元凋亡.5.眼镜蛇毒磷脂酶A<,2>保护CGNs作用和磷脂酶A2活性分离.因为化学修饰使眼镜蛇毒磷脂酶A<,2>酶活性几乎消失,而保护CGNs的能力保留;热处理后的眼镜蛇毒磷脂酶A<,2>酶活性保留,而保护CGNs的能力大幅度降低;多个蛇毒和蜂毒来源的磷脂酶A<,2>活性和对CGNs的保护效价EC<,50>没有相关.
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