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我们从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选得到一条新的cDNA,经NCBI比对分析后初步确定其为一未知基因,命名为家蚕Bm050524(Bombyxmor.050524)。家蚕Bm050524基因cDNA长为51.bp,开放阅读框大小为48.bp,采用NCBI在线OR.finder进行预测发现该基因编码160个氨基酸残基,预测分子量大小为18.5.kD,等电点为5.11。从GenBank等数据库中利用Blast检索,发现与Bm050524同源性较高的均为一些假设或预测蛋白,这些蛋白功能未知。将家蚕Bm050524的cDNA序列与家蚕基因组序列比对,结果表明该基因由三个外显子组成。
我们根据cDNA序列的ORF设计上下游引物,PCR扩增后经Bam.I和XhoI双酶切,插入表达载体pET-28a(+)的相应酶切位点构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经PCR、酶切鉴定以及测序分析证实重组正确。IPTG诱导后裂解菌作SDS-PAGE分析,在2.kD处有特异性蛋白条带,与预期值相符。重组蛋白以包涵体的形式表达,我们在菌体裂解液中加入了Sarkosyl然后用超声的方法裂解包涵体,通过亲和层析纯化重组蛋白,使用重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA检测效价大于1:51200。提取家蚕五龄幼虫七个组织的总蛋白,进行荧光免疫印迹实验,结果显示:Bm050524蛋白在家蚕头部、表皮、丝腺、中肠、脂肪体、马氏管、气门等七个组织均有表达。以家蚕Bm5细胞进行免疫细胞化学实验,细胞定位结果显示:在未分裂细胞中,Bm050524蛋白主要在细胞质分布:而对于处在分裂期的细胞,Bm050524蛋白在分裂细胞核两级表达量要高于胞质其它部位。利用荧光定量PCR的方法,检测家蚕四个发育时期,和五龄幼虫九个组织中的mRNA的转录情况,发现Bm050524基因在蛹期和头部的转录较高。这些结果为深入研究Bm050524基因奠定了基础。