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ETEC是一类导致人和幼畜腹泻(初生仔猪、犊牛、羔羊和断奶仔猪)的病原性大肠杆菌,主要有两类致病因子:一类为肠毒素,另一类为黏附素(或称定居因子)。菌体产生的多种外毒素在大肠杆菌致病性中扮演了重要角色,其中耐热性肠毒素即为其产生的主要外毒素。
本研究首先利用PCR技术,从产肠毒素性大肠杆菌强毒株C83922中克隆出STI基因,进一步通过PCR和寡核苷酸定点突变技术,将耐热性肠毒素STI毒素中心的3个Cys分别突变成Ser和Gly,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,获得了该突变基因的重组菌株。在此基础上,对重组菌株的诱导表达产物进行了Tricine-SDS-PAGE和Western blotting分析;并对蛋白的毒性进行了研究。从而为进一步研制预防产肠毒素性大肠杆菌引起的犊牛、羔羊坏死性肠炎等疾病提供理想的基因工程候选菌株。研究结果如下:
1.利用PCR技术,从产肠毒素性大肠杆菌强毒株C83922中克隆出STI毒素基因,并进行了核苷酸序列测定。结果表明,核苷酸序列与国外报道的序列一致。
2.通过PCR和寡核苷酸定点突变技术,将耐热性肠毒素STI毒素中心的3个Cys分别突变成Ser和Gly,并且成功获得了大肠杆菌耐热性肠毒素STI的6种突变体(Cys→Gly):STIC10/G、STIC14/G、STIC17/G,突变体(Cys→Ser):STIC10/S、STIC14/S、STIC17/S。在此基础上,进一步成功构建了含有6种STI突变体的分泌型表达载体pESG10、pESG14、pESG17、pESS10、pESS14、pESS17及相应的重组菌株。
3.对重组菌株经IPTG诱导后,将表达产物进行Tricine-SDS-PAGE和Western blotting分析,结果表明,该重组菌株可以表达耐热性肠毒素STI突变体蛋白,蛋白含量占菌体总蛋白最高比例可达30%。并且表达的突变体蛋白能够被抗血清特异性识别。
4.对重组菌株进行了毒性研究,动物实验表明重组菌株毒性明显减弱。