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硒是鱼类维持其正常生长的必需微量元素，主要通过合成到硒蛋白中以发挥其生物学功能，硒缺乏与过量均不利于鱼类的正常生长。然而，迄今为止，硒对鱼类生长的调控机制却仍不十分清楚。骨骼肌(主要为白肌)占鱼类躯体总重的40%-60%，是鱼类躯体中最大的组织，大量研究表明，骨骼肌的生长对鱼类躯体的生长起到了决定性的作用，我们推测硒对鱼类躯体生长的调控可能主要通过对肌肉生长的调控来实现。骨骼肌的基本结构单位为肌纤维，从肌纤维的层面来看，骨骼肌的形成过程本质上是肌纤维数目的增加(增生)及肌纤维体积的增加(肥大)。在鱼类中，根据最终体型大小的差别，骨骼肌的生长模式主要分为两种类型，即以大型鱼类为代表的非限定性生长模式和以小型鱼类为代表的限定性生长模式。在非限定性生长鱼类中，肌肉的生长主要由肌纤维增生和肥大共同实现；而在限定性生长鱼类中，肌肉的生长主要由肌纤维肥大来实现，肌纤维增生十分稀少。
本研究分别选取了非限定性生长鱼类的典型代表虹鳟(Oncorhynchus mykiss)及限定性生长鱼类的典型代表斑马鱼(Danio rerio)作为研究对象，并通过日粮干预的方式，针对硒对不同生长模式鱼类肌肉生长的调控作用及机制进行了探究，旨在从肌肉生长角度来探讨硒对鱼类的生长性能进行调控的潜在机制。主要研究内容及结果如下：
1.日粮硒对非限定性生长鱼类虹鳟肌肉生长的调控作用及机制探究
我们首先通过向基础饲料中添加不同水平酵母硒(硒添加量分别为0，2，4和6mg/kg)的方式探究了不同日粮硒水平(1.01，2.58，4.36和6.26mg/kg)对虹鳟生长及机体硒状态的影响。经10周养殖后，对全鱼及组织中硒沉积、生长性能、组织氧化状态、组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性及28个硒蛋白(Sel)基因的转录情况进行了分析。发现：虹鳟饲料中基于酵母硒添加物的适宜硒添加水平为4mg/kg，此剂量下，虹鳟表现出最高生长速率、最低氧化压力及最适宜硒状态。
根据前期实验所确定的日粮硒水平与虹鳟生长及机体硒状态的关系，我们进一步以酵母硒在营养剂量范围内进行添加(硒添加量分别为0，2和4mg/kg，日粮硒水平分别为0.75，2.60和4.68mg/kg)，探究营养剂量硒对虹鳟肌肉生长的影响及潜在机制。经30d养殖后，对虹鳟的生长性能、肌肉生长、肌肉生长模式及基础代谢水平下(停食48h)的肌肉生长相关生物学过程进行了分析。结果显示，日粮硒的添加促进了虹鳟的躯体生长及肌肉生长(P<0.05)，并且，躯体的生长速率与肌肉的生长速率显著正相关(P<0.01)。对虹鳟泄殖孔水平横截面白肌纤维的组织学分析结果显示，在整个养殖实验期间，虹鳟肌肉的生长由肌纤维增生(贡献率为53.77%-56.56%)与肥大(贡献率为43.44%-46.23%)所共同实现。尽管日粮硒的添加同时促进了虹鳟白肌纤维的增生与肥大(P<0.05)，然而，值得注意的是，经日粮硒的添加之后，肌纤维肥大对白肌面积增长的贡献率显著升高，肌纤维增生的贡献率则显著降低(P<0.05)，表明营养剂量硒主要通过调节肌纤维肥大以调节虹鳟肌肉生长。通过对肌纤维肥大相关生物学途径的分析，我们发现日粮硒的添加显著促进了虹鳟肌肉中成肌细胞与成熟肌纤维的融合，且抑制了钙蛋白酶系统活性及叉头框蛋白O3a(FoxO3a)-Fbx32通路介导的蛋白质泛素化降解(P<0.05)，但对蛋白质合成相关通路活性无显著影响。进一步对虹鳟血浆及白肌中四碘甲状腺素(T4)-三碘甲状腺素(T3)-生长激素(GH)-胰岛素样生长因子1(IGF1)轴相关激素水平的分析发现，在血浆中，日粮硒的添加对T4、T3、GH及IGF1水平均无显著影响，在肌肉中，日粮硒的添加尽管显著提高了T4和T3水平(P<0.05)，但对GH及IGF1水平并无显著影响。对虹鳟肌肉中硒蛋白基因转录情况的分析发现，日粮硒的添加显著上调了GPX4b，SelK，SelP，SelU和SelWl的表达，在这5个差异表达硒蛋白基因中，SelK和SelWl的mRNA丰度与虹鳟的躯体生长及肌肉生长相关指标均显著相关(P<0.05)。本实验的结果表明，营养剂量硒(1)促进了成肌细胞与成熟肌纤维融合，(2)通过抑制钙蛋白酶系统和FoxO3a-Fbx32介导的蛋白质泛素化降解，加速肌纤维中的蛋白质沉积。通过以上两种方式，营养剂量硒促进了虹鳟白肌纤维的肥大，从而促进白肌生长，并最终实现对虹鳟躯体生长的促进作用。此外，营养剂量硒主要通过调节肌肉中相关硒蛋白的表达来调节虹鳟肌肉的生长，而非依赖于T4-T3-GH-IGF1轴，SelK和SelW可能是参与虹鳟肌肉生长调控的两个关键硒蛋白。
在前期研究中，我们分析了营养剂量硒对基础代谢水平下虹鳟肌肉中蛋白质沉积的影响，然而鱼类组织中的蛋白质合成与降解对组织中氨基酸水平极其敏感，并在摄食后随组织氨基酸水平的变化而动态变化，为更加全面地探究硒对虹鳟肌肉中蛋白质沉积的影响，本实验以餐后代谢模型进一步探究了营养剂量硒对餐后24h内虹鳟白肌中蛋白质合成与降解的影响。在本实验中，虹鳟分别被饲以基础饲料以及向基础饲料中以酵母硒形式添加4mg/kg硒的实验饲料(两组饲料总硒含量分别为0.75和4.68mg/kg)。经6周养殖后，日粮硒的添加显著增加了虹鳟的体重、体长及肌肉中的蛋白质含量(P<0.05)，随后对虹鳟停食48h，并以相应的饲料进行一次饱食投喂，分别于投喂前及投喂后4，8，12及24h对肌肉中蛋白合成与降解相关途径的活性进行分析。结果显示，对虹鳟肌肉中蛋白质合成途径而言，日粮硒的添加显著提高了餐后8-12h内核糖体蛋白S6的磷酸化水平以及餐后4-24h内真核翻译起始因子4E绑定蛋白1(4E-BP1)的磷酸化水平(P<0.05)，而对餐后24h内的RNA/DNA、核糖体RNA含量、真核翻译起始因子2α(eIF2α)和真核翻译延伸因子2(eEF2)的磷酸化水平均无显著影响；对虹鳟肌肉中蛋白质降解途径而言，日粮硒的添加对餐后24h内的钙蛋白酶系统、自噬-溶酶体途径及泛素-蛋白酶体途径的活性均无显著影响。本实验的结果表明，在餐后24h内，营养剂量硒促进并延长了TORC1途径介导的蛋白质合成，从而加快虹鳟肌肉中的蛋白质沉积。
2.日粮硒对限定性生长鱼类斑马鱼肌肉生长的调控作用及机制探究
首先通过向基础饲料中添加不同水平酵母硒的方式探究不同日粮硒水平(0.10，0.22，0.34，0.44，0.57和0.69mg/kg)对生长期斑马鱼生长及机体硒状态的影响。经30d的养殖后，对斑马鱼生长性能以及全鱼硒沉积、氧化状态、GPX活性及37个硒蛋白基因的转录情况进行了分析。发现：基于酵母硒添加物，斑马鱼的最适日粮硒水平为0.32-0.37mg/kg，此剂量下，斑马鱼机体处于理想硒状态，机体表现出较高的生长速率及较低的氧化状态。而当日粮硒水平低于0.32mg/kg和高于0.44mg/kg时，斑马鱼机体分别处于硒缺乏和过量状态，表现出生长减缓和机体氧化压力增加。
根据前期实验所确定的日粮硒水平与斑马鱼生长及机体硒状态的关系，本研究进一步探究了不同硒状态对斑马鱼肌肉生长的影响及其机制。本实验对斑马鱼饲以不同日粮硒水平(0.10，0.22，0.34，0.44，0.57和0.69mg/kg)的饲料30d，随后对肌肉生长、肌肉生长模式及肌肉生长相关生物学过程进行分析。结果显示，在适宜硒状态下(日粮硒水平为0.32-0.37mg/kg)，斑马鱼肌肉高速生长，而在硒缺乏及过量状态下(日粮硒水平分别低于0.32mg/kg和高于0.44mg/kg)，斑马鱼肌肉生长受到抑制，相关性分析结果显示，斑马鱼躯体的生长速率与肌肉的生长速率显著正相关(P<0.01)。对斑马鱼泄殖孔水平横截面白肌纤维的组织学分析结果显示，在整个养殖实验期间，斑马鱼肌肉中仅存在少量肌纤维增生(肌纤维总数增加11.63%-15.81%，肌纤维增生贡献率为14.49%-21.52%)，肌肉的生长主要由肌纤维肥大来实现(肥大贡献率为78.48%-85.51%)。进一步分析发现，机体硒状态主要通过调节斑马鱼肌肉中的蛋白质沉积以调节肌纤维肥大，而对成肌细胞与成熟肌纤维的融合事件并无显著影响。对蛋白质合成及降解相关通路活性的分析结果显示，相比于适宜硒状态，缺硒状态下斑马鱼肌肉中的蛋白质合成速率降低而自噬活性增加，而硒过量状态下斑马鱼肌肉中的蛋白质合成与降解均未受到影响。进一步对斑马鱼肌肉中T4-T3-GH-IGF1轴相关激素水平的分析发现，不同硒状态下，斑马鱼肌肉中的T4、T3、GH及IGF1水平的变化规律与斑马鱼的肌肉生长情况并不相符。对斑马鱼肌肉中37个硒蛋白基因的转录情况的分析发现，日粮硒水平的增加显著上调了4个硒蛋白基因(GPX1a、GPX4a、SelU1a和SelW1)的表达。相关性分析结果显示，在营养剂量硒范围内(日粮硒水平为0.10-0.34mg/kg)，SelW1的mRNA丰度与斑马鱼的躯体生长及肌肉生长相关指标均显著相关(P<0.05)。本实验的结果表明，机体硒状态与斑马鱼肌肉的生长息息相关，硒缺乏及过量均不利于斑马鱼肌肉的生长。另外，本研究初步揭示了营养剂量硒对斑马鱼肌肉生长的调控机制：通过上调肌肉中SelW的表达，促进肌肉中的蛋白质合成并抑制自噬介导的蛋白质降解，以促进斑马鱼肌肉的肥大性生长，从而促进斑马鱼躯体的生长。另外，本研究的结果表明过量硒通过抑制斑马鱼肌肉的肥大性生长以抑制其躯体生长，然而，关于其更深层次的调控机制却仍不清楚。
综上所述，本研究主要从硒的营养必要性角度入手，探究了日粮硒对不同生长类型鱼类肌肉生长的影响，并初步揭示了营养剂量硒通过上调鱼类肌肉中SelW的表达，加快蛋白质的沉积，促进肌肉肥大性生长，从而调节鱼类躯体生长的潜在规律。本研究的结果能够丰富我们对于鱼类硒营养功能的认识，并为进一步深入研究硒对鱼类生长性能的调控机制奠定了重要基础。
本研究分别选取了非限定性生长鱼类的典型代表虹鳟(Oncorhynchus mykiss)及限定性生长鱼类的典型代表斑马鱼(Danio rerio)作为研究对象，并通过日粮干预的方式，针对硒对不同生长模式鱼类肌肉生长的调控作用及机制进行了探究，旨在从肌肉生长角度来探讨硒对鱼类的生长性能进行调控的潜在机制。主要研究内容及结果如下：
1.日粮硒对非限定性生长鱼类虹鳟肌肉生长的调控作用及机制探究
我们首先通过向基础饲料中添加不同水平酵母硒(硒添加量分别为0，2，4和6mg/kg)的方式探究了不同日粮硒水平(1.01，2.58，4.36和6.26mg/kg)对虹鳟生长及机体硒状态的影响。经10周养殖后，对全鱼及组织中硒沉积、生长性能、组织氧化状态、组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性及28个硒蛋白(Sel)基因的转录情况进行了分析。发现：虹鳟饲料中基于酵母硒添加物的适宜硒添加水平为4mg/kg，此剂量下，虹鳟表现出最高生长速率、最低氧化压力及最适宜硒状态。
根据前期实验所确定的日粮硒水平与虹鳟生长及机体硒状态的关系，我们进一步以酵母硒在营养剂量范围内进行添加(硒添加量分别为0，2和4mg/kg，日粮硒水平分别为0.75，2.60和4.68mg/kg)，探究营养剂量硒对虹鳟肌肉生长的影响及潜在机制。经30d养殖后，对虹鳟的生长性能、肌肉生长、肌肉生长模式及基础代谢水平下(停食48h)的肌肉生长相关生物学过程进行了分析。结果显示，日粮硒的添加促进了虹鳟的躯体生长及肌肉生长(P<0.05)，并且，躯体的生长速率与肌肉的生长速率显著正相关(P<0.01)。对虹鳟泄殖孔水平横截面白肌纤维的组织学分析结果显示，在整个养殖实验期间，虹鳟肌肉的生长由肌纤维增生(贡献率为53.77%-56.56%)与肥大(贡献率为43.44%-46.23%)所共同实现。尽管日粮硒的添加同时促进了虹鳟白肌纤维的增生与肥大(P<0.05)，然而，值得注意的是，经日粮硒的添加之后，肌纤维肥大对白肌面积增长的贡献率显著升高，肌纤维增生的贡献率则显著降低(P<0.05)，表明营养剂量硒主要通过调节肌纤维肥大以调节虹鳟肌肉生长。通过对肌纤维肥大相关生物学途径的分析，我们发现日粮硒的添加显著促进了虹鳟肌肉中成肌细胞与成熟肌纤维的融合，且抑制了钙蛋白酶系统活性及叉头框蛋白O3a(FoxO3a)-Fbx32通路介导的蛋白质泛素化降解(P<0.05)，但对蛋白质合成相关通路活性无显著影响。进一步对虹鳟血浆及白肌中四碘甲状腺素(T4)-三碘甲状腺素(T3)-生长激素(GH)-胰岛素样生长因子1(IGF1)轴相关激素水平的分析发现，在血浆中，日粮硒的添加对T4、T3、GH及IGF1水平均无显著影响，在肌肉中，日粮硒的添加尽管显著提高了T4和T3水平(P<0.05)，但对GH及IGF1水平并无显著影响。对虹鳟肌肉中硒蛋白基因转录情况的分析发现，日粮硒的添加显著上调了GPX4b，SelK，SelP，SelU和SelWl的表达，在这5个差异表达硒蛋白基因中，SelK和SelWl的mRNA丰度与虹鳟的躯体生长及肌肉生长相关指标均显著相关(P<0.05)。本实验的结果表明，营养剂量硒(1)促进了成肌细胞与成熟肌纤维融合，(2)通过抑制钙蛋白酶系统和FoxO3a-Fbx32介导的蛋白质泛素化降解，加速肌纤维中的蛋白质沉积。通过以上两种方式，营养剂量硒促进了虹鳟白肌纤维的肥大，从而促进白肌生长，并最终实现对虹鳟躯体生长的促进作用。此外，营养剂量硒主要通过调节肌肉中相关硒蛋白的表达来调节虹鳟肌肉的生长，而非依赖于T4-T3-GH-IGF1轴，SelK和SelW可能是参与虹鳟肌肉生长调控的两个关键硒蛋白。
在前期研究中，我们分析了营养剂量硒对基础代谢水平下虹鳟肌肉中蛋白质沉积的影响，然而鱼类组织中的蛋白质合成与降解对组织中氨基酸水平极其敏感，并在摄食后随组织氨基酸水平的变化而动态变化，为更加全面地探究硒对虹鳟肌肉中蛋白质沉积的影响，本实验以餐后代谢模型进一步探究了营养剂量硒对餐后24h内虹鳟白肌中蛋白质合成与降解的影响。在本实验中，虹鳟分别被饲以基础饲料以及向基础饲料中以酵母硒形式添加4mg/kg硒的实验饲料(两组饲料总硒含量分别为0.75和4.68mg/kg)。经6周养殖后，日粮硒的添加显著增加了虹鳟的体重、体长及肌肉中的蛋白质含量(P<0.05)，随后对虹鳟停食48h，并以相应的饲料进行一次饱食投喂，分别于投喂前及投喂后4，8，12及24h对肌肉中蛋白合成与降解相关途径的活性进行分析。结果显示，对虹鳟肌肉中蛋白质合成途径而言，日粮硒的添加显著提高了餐后8-12h内核糖体蛋白S6的磷酸化水平以及餐后4-24h内真核翻译起始因子4E绑定蛋白1(4E-BP1)的磷酸化水平(P<0.05)，而对餐后24h内的RNA/DNA、核糖体RNA含量、真核翻译起始因子2α(eIF2α)和真核翻译延伸因子2(eEF2)的磷酸化水平均无显著影响；对虹鳟肌肉中蛋白质降解途径而言，日粮硒的添加对餐后24h内的钙蛋白酶系统、自噬-溶酶体途径及泛素-蛋白酶体途径的活性均无显著影响。本实验的结果表明，在餐后24h内，营养剂量硒促进并延长了TORC1途径介导的蛋白质合成，从而加快虹鳟肌肉中的蛋白质沉积。
2.日粮硒对限定性生长鱼类斑马鱼肌肉生长的调控作用及机制探究
首先通过向基础饲料中添加不同水平酵母硒的方式探究不同日粮硒水平(0.10，0.22，0.34，0.44，0.57和0.69mg/kg)对生长期斑马鱼生长及机体硒状态的影响。经30d的养殖后，对斑马鱼生长性能以及全鱼硒沉积、氧化状态、GPX活性及37个硒蛋白基因的转录情况进行了分析。发现：基于酵母硒添加物，斑马鱼的最适日粮硒水平为0.32-0.37mg/kg，此剂量下，斑马鱼机体处于理想硒状态，机体表现出较高的生长速率及较低的氧化状态。而当日粮硒水平低于0.32mg/kg和高于0.44mg/kg时，斑马鱼机体分别处于硒缺乏和过量状态，表现出生长减缓和机体氧化压力增加。
根据前期实验所确定的日粮硒水平与斑马鱼生长及机体硒状态的关系，本研究进一步探究了不同硒状态对斑马鱼肌肉生长的影响及其机制。本实验对斑马鱼饲以不同日粮硒水平(0.10，0.22，0.34，0.44，0.57和0.69mg/kg)的饲料30d，随后对肌肉生长、肌肉生长模式及肌肉生长相关生物学过程进行分析。结果显示，在适宜硒状态下(日粮硒水平为0.32-0.37mg/kg)，斑马鱼肌肉高速生长，而在硒缺乏及过量状态下(日粮硒水平分别低于0.32mg/kg和高于0.44mg/kg)，斑马鱼肌肉生长受到抑制，相关性分析结果显示，斑马鱼躯体的生长速率与肌肉的生长速率显著正相关(P<0.01)。对斑马鱼泄殖孔水平横截面白肌纤维的组织学分析结果显示，在整个养殖实验期间，斑马鱼肌肉中仅存在少量肌纤维增生(肌纤维总数增加11.63%-15.81%，肌纤维增生贡献率为14.49%-21.52%)，肌肉的生长主要由肌纤维肥大来实现(肥大贡献率为78.48%-85.51%)。进一步分析发现，机体硒状态主要通过调节斑马鱼肌肉中的蛋白质沉积以调节肌纤维肥大，而对成肌细胞与成熟肌纤维的融合事件并无显著影响。对蛋白质合成及降解相关通路活性的分析结果显示，相比于适宜硒状态，缺硒状态下斑马鱼肌肉中的蛋白质合成速率降低而自噬活性增加，而硒过量状态下斑马鱼肌肉中的蛋白质合成与降解均未受到影响。进一步对斑马鱼肌肉中T4-T3-GH-IGF1轴相关激素水平的分析发现，不同硒状态下，斑马鱼肌肉中的T4、T3、GH及IGF1水平的变化规律与斑马鱼的肌肉生长情况并不相符。对斑马鱼肌肉中37个硒蛋白基因的转录情况的分析发现，日粮硒水平的增加显著上调了4个硒蛋白基因(GPX1a、GPX4a、SelU1a和SelW1)的表达。相关性分析结果显示，在营养剂量硒范围内(日粮硒水平为0.10-0.34mg/kg)，SelW1的mRNA丰度与斑马鱼的躯体生长及肌肉生长相关指标均显著相关(P<0.05)。本实验的结果表明，机体硒状态与斑马鱼肌肉的生长息息相关，硒缺乏及过量均不利于斑马鱼肌肉的生长。另外，本研究初步揭示了营养剂量硒对斑马鱼肌肉生长的调控机制：通过上调肌肉中SelW的表达，促进肌肉中的蛋白质合成并抑制自噬介导的蛋白质降解，以促进斑马鱼肌肉的肥大性生长，从而促进斑马鱼躯体的生长。另外，本研究的结果表明过量硒通过抑制斑马鱼肌肉的肥大性生长以抑制其躯体生长，然而，关于其更深层次的调控机制却仍不清楚。
综上所述，本研究主要从硒的营养必要性角度入手，探究了日粮硒对不同生长类型鱼类肌肉生长的影响，并初步揭示了营养剂量硒通过上调鱼类肌肉中SelW的表达，加快蛋白质的沉积，促进肌肉肥大性生长，从而调节鱼类躯体生长的潜在规律。本研究的结果能够丰富我们对于鱼类硒营养功能的认识，并为进一步深入研究硒对鱼类生长性能的调控机制奠定了重要基础。