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近年来，鱼藤酮（Rotenone）作为杀虫剂在农业生产中使用量逐年递增。流行病学研究表明长期接触鱼藤酮农药的人群帕金森病（Parkinson’s disease,PD）发病率为非接触人群的2.5-5.8倍。PD是全球第二大老化相关的神经退行性疾病，该病以运动迟缓、姿势步态异常、肌强直和静止性震颤为主要临床特征，病理特征主要表现为中脑和纹状体多巴胺能（dopaminergic,DA）神经元变性、坏死、丢失，并伴有α-突触核蛋白（α-synuclein）蓄积形成路易小体（Lewy body,LB）。目前研究表明，基因遗传、氧化应激、线粒体功能障碍、神经炎症、环境化学毒物暴露等均参与DA神经元损伤。其中炎症反应尤其是小胶质细胞活化介导的神经炎症在DA神经元变性坏死中发挥关键的作用。CXC趋化因子受体2（CXCR2）是一种趋化因子受体，可与CXC趋化因子1（CXCL1）、CXCL2、白介素-8（Interleukin-8,IL-8）等配体结合，促进免疫细胞的聚集和活化，在多种炎症性疾病中发挥重要作用。但是，CXCR2能否介导小胶质细胞活化和引发神经炎症，进而调控DA神经元损伤及其机制不清楚。
目的：
本课题通过鱼藤酮处理建立PD小鼠模型，研究CXCR2在DA神经元损伤中的调控作用，并阐明其作用的分子机制。为寻找防治鱼藤酮暴露DA神经元的损伤提供新靶点。
方法：
1.动物模型建立：80只成年SPF级雄性C57BL/6J小鼠，适应性喂养7天后，按体重随机分为对照组（Con）、模型组（Rot）、鱼藤酮+CXCR2抑制剂（SB225002）组（Rot+SB225002）、CXCR2抑制剂组（SB225002），每组20只。鱼藤酮按照1.5mg/kg/天、SB225002按照2mg/kg/天经腹注射，每天一次，连续3周。对照组给予相同剂量生理盐水。染毒结束后，麻醉小鼠（n=10只/组），经4%多聚甲醛灌注5分钟，取脑组织用于病理切片观察。其余小鼠（n=10只/组）经生理盐水灌注后，冰上迅速剥离脑组织并分离中脑、纹状体，放入液氮速冻后转入-80℃保存备用。
2.免疫荧光和免疫组化染色：制备脑冰冻切片，应用CXCR2、α-synuclein、p-α-synuclein（S129）抗体进行免疫荧光染色。应用anti-TH（中脑和纹状体多巴胺能神经元标记物）抗体进行免疫组化染色，分别观察神经元数量和密度；应用anti-Iba-1（小胶质细胞活化标记物）抗体进行免疫组化染色，观察小胶质细胞的活化水平。
3.qPCR分析：检测小胶质细胞M1极化标记物（iNOS、TNF-α和IL-1β）和M2极化标记物（Arg-1、Ym-1、CD206）的mRNA水平。
4.Western blot分析：检测中脑和纹状体组织CXCR2、α-synuclein、p-α-synuclein（S129）、Iba1、INOS、Arg-1、STAT1、NF-κB蛋白表达水平。
结果：
1.在鱼藤酮PD小鼠中CXCR2表达水平增高：与Con组比较，Rot组CXCR2表达水平明显升高（p＜0.01）。
2.抑制CXCR2活性减轻鱼藤酮PD小鼠多巴胺能神经元损伤：与Con组相比，Rot组小鼠中脑DA神经元数量和纹状体TH染色光密度明显降低（p＜0.01）；相反Rot+SB225002组小鼠中脑DA神经元数量增多（p＜0.01）和纹状体TH染色光密度明显升高（p＜0.05）。
3.抑制CXCR2活性降低鱼藤酮PD小鼠中脑和纹状体α-突触核蛋白表达与磷酸化水平：与Con相比，Rot组小鼠中脑和纹状体α-synuclein和p-α-synuclein（S129）蛋白水平均明显升高（p＜0.01）；而Rot+SB225002组小鼠α-synuclein和p-α-synuclein（S129）蛋白水平明显降低（p＜0.01）。
4.抑制CXCR2活性改善鱼藤酮PD小鼠步态异常：小鼠足迹分析结果显示与Con组相比，Rot组小鼠步长降低、步距增加（p＜0.05）；而，Rot+SB225002组小鼠步长增加、步距降低（p＜0.05）。
5.抑制CXCR2活性降低中脑和纹状体小胶质细胞活化和M1极化水平：与Con组相比，Rot组小鼠中脑和纹状体Iba-1和M1极化相关因子（INOS、IL-1β、TNF-α）表达水平明显升高，而Arg1表达水平明显降低（p＜0.01）。相反，这些改变在Rot+SB225002组的到明显逆转（p＜0.01）。
6.抑制CXCR2活性减弱中脑NF-κB和STAT1信号通路活化：与Con组相比，Rot组小鼠p-STAT1、p-P65、p-IκBα表达明显升高（p＜0.01）和IκBα水平明显降低（p＜0.01）；而Rot+SB225002组p-STAT1、p-P65、p-IκBα表达明显降低（p＜0.01）和IκBα水平明显升高（p＜0.05）。
结论：
在鱼藤酮暴露时，趋化因子受体CXCR2可通过激活STAT1和NF-κB信号通路介导小胶质细胞M1极化引发神经炎症，进而损伤小鼠DA神经元；相反抑制CXCR2可改善这些损伤作用，提示CXCR2可能作为干预PD的一个潜在新靶点。
目的：
本课题通过鱼藤酮处理建立PD小鼠模型，研究CXCR2在DA神经元损伤中的调控作用，并阐明其作用的分子机制。为寻找防治鱼藤酮暴露DA神经元的损伤提供新靶点。
方法：
1.动物模型建立：80只成年SPF级雄性C57BL/6J小鼠，适应性喂养7天后，按体重随机分为对照组（Con）、模型组（Rot）、鱼藤酮+CXCR2抑制剂（SB225002）组（Rot+SB225002）、CXCR2抑制剂组（SB225002），每组20只。鱼藤酮按照1.5mg/kg/天、SB225002按照2mg/kg/天经腹注射，每天一次，连续3周。对照组给予相同剂量生理盐水。染毒结束后，麻醉小鼠（n=10只/组），经4%多聚甲醛灌注5分钟，取脑组织用于病理切片观察。其余小鼠（n=10只/组）经生理盐水灌注后，冰上迅速剥离脑组织并分离中脑、纹状体，放入液氮速冻后转入-80℃保存备用。
2.免疫荧光和免疫组化染色：制备脑冰冻切片，应用CXCR2、α-synuclein、p-α-synuclein（S129）抗体进行免疫荧光染色。应用anti-TH（中脑和纹状体多巴胺能神经元标记物）抗体进行免疫组化染色，分别观察神经元数量和密度；应用anti-Iba-1（小胶质细胞活化标记物）抗体进行免疫组化染色，观察小胶质细胞的活化水平。
3.qPCR分析：检测小胶质细胞M1极化标记物（iNOS、TNF-α和IL-1β）和M2极化标记物（Arg-1、Ym-1、CD206）的mRNA水平。
4.Western blot分析：检测中脑和纹状体组织CXCR2、α-synuclein、p-α-synuclein（S129）、Iba1、INOS、Arg-1、STAT1、NF-κB蛋白表达水平。
结果：
1.在鱼藤酮PD小鼠中CXCR2表达水平增高：与Con组比较，Rot组CXCR2表达水平明显升高（p＜0.01）。
2.抑制CXCR2活性减轻鱼藤酮PD小鼠多巴胺能神经元损伤：与Con组相比，Rot组小鼠中脑DA神经元数量和纹状体TH染色光密度明显降低（p＜0.01）；相反Rot+SB225002组小鼠中脑DA神经元数量增多（p＜0.01）和纹状体TH染色光密度明显升高（p＜0.05）。
3.抑制CXCR2活性降低鱼藤酮PD小鼠中脑和纹状体α-突触核蛋白表达与磷酸化水平：与Con相比，Rot组小鼠中脑和纹状体α-synuclein和p-α-synuclein（S129）蛋白水平均明显升高（p＜0.01）；而Rot+SB225002组小鼠α-synuclein和p-α-synuclein（S129）蛋白水平明显降低（p＜0.01）。
4.抑制CXCR2活性改善鱼藤酮PD小鼠步态异常：小鼠足迹分析结果显示与Con组相比，Rot组小鼠步长降低、步距增加（p＜0.05）；而，Rot+SB225002组小鼠步长增加、步距降低（p＜0.05）。
5.抑制CXCR2活性降低中脑和纹状体小胶质细胞活化和M1极化水平：与Con组相比，Rot组小鼠中脑和纹状体Iba-1和M1极化相关因子（INOS、IL-1β、TNF-α）表达水平明显升高，而Arg1表达水平明显降低（p＜0.01）。相反，这些改变在Rot+SB225002组的到明显逆转（p＜0.01）。
6.抑制CXCR2活性减弱中脑NF-κB和STAT1信号通路活化：与Con组相比，Rot组小鼠p-STAT1、p-P65、p-IκBα表达明显升高（p＜0.01）和IκBα水平明显降低（p＜0.01）；而Rot+SB225002组p-STAT1、p-P65、p-IκBα表达明显降低（p＜0.01）和IκBα水平明显升高（p＜0.05）。
结论：
在鱼藤酮暴露时，趋化因子受体CXCR2可通过激活STAT1和NF-κB信号通路介导小胶质细胞M1极化引发神经炎症，进而损伤小鼠DA神经元；相反抑制CXCR2可改善这些损伤作用，提示CXCR2可能作为干预PD的一个潜在新靶点。