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鸭瘟(Duck Plague, DP)又称鸭病毒性肠炎(Duck Viral Enteritis, DVE),是由鸭瘟病毒(Duck Plague Virus, DPV)引起的主要危害鸭、鹅等雁行目禽类的一种急性、热性和败血性的接触性传染病。基因疫苗以特有的优势在基因工程疫苗的研究中备受关注。本研究以鸭瘟病毒UL24基因(DPV UL24)为靶基因,以大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(E.coli LTB)基因为基因佐剂,进行了DPV基因疫苗的构建与免疫原性研究,获得以下结果：1.E.coli LTB基因的克隆及真核表达质粒的构建采用PCR扩增E.coli K88ac的LTB基因,将其插入pMD18-T载体,构建重组质粒pMD18-T/LTB。测序分析表明：克隆的E.coli LTB基因长度为414bp,与GenBank公布的LTB序列(Accession:EU113245.1)相似性为100%。以pVAX1为载体,分别构建了真核表达质粒pVAX1-LTB、pVAX1-UL24以及pVAX1-LTB-UL24。酶切鉴定表明,成功构建了上述三种真核表达质粒。2.重组减毒沙门氏菌的构建及其生物学特性研究将真核表达质粒pVAXl-LTB、pVAX1-UL24和pVAX1-LTB-UL24分别电转化入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207中,构建携带真核表达质粒的重组减毒沙门氏菌SL7207(LTB)、SL7207(UL24)和SL7207(LTB-UL24)。对重组沙门氏菌进行革兰氏镜检和生化试验,并在体外检测重组减毒沙门氏菌的质粒稳定性。结果表明,三种重组减毒沙门氏菌的生物学特性与SL7207一致,且在抗生素环境下16h内,质粒在沙门氏菌内的稳定性在90%以上。将重组减毒沙门氏菌体外感染鸭胚成纤维细胞,通过间接免疫荧光证实：表达质粒pVAX1-UL24和pVAX1-LTB-UL24被有效传递入细胞,且能对目的蛋白进行表达；通过RT-PCR证实：质粒pVAX1-LTB在传递入细胞中进行了有效转录。3.重组减毒沙门氏菌的体内表达及其安全性检测鸭口服SL7207(LTB)+SL7207(UL24)、SL7207(UL24)和SL7207(LTB-UL24)后,分别提取鸭回肠末端肠道细胞总RNA作为模板,通过RT-PCR分别检测到LTB基因、UL24基因和LTB-UL24基因转录。将重组菌SL7207(LTB-UL24)以1×109, 1×1010与1×1011CFU/只的剂量口服免疫鸭,试验组与对照组之间的体重无显著性差异；在免疫后第8w,免疫鸭粪便、肝脏和脾脏检测不出重组减毒沙门氏菌。结果表明,重组减毒沙门氏菌具有良好的安全性。4.鸭瘟病毒UL24基因疫苗免疫原性研究以7日龄雏鸭为试验动物,按照免疫剂量为200μg/只的基因疫苗pVAX1-UL24、pVAX 1-LTB+p VAX 1-UL24和pVAXl-LTB-UL24分别进行雏鸭腿部肌肉注射,免疫剂量为1×1010CFU/只的SL7207(LTB)+SL7207(UL24)、SL7207(UL24)和免疫剂量为1×109、1×1010与1×1011CFU/只的SL7207(LTB-UL24)分别进行口服,间隔两周加强免疫一次,共免疫3次。分别在免疫后1w、2w、3w、4w、5w、6w、7w和8w通过间接ELISA测定免疫鸭各器官特异性DPV IgG、IgA和IgM抗体水平。结果表明：肌注免疫组能有效诱导体液产生特异性DPV IgG、IgA和IgM,口服免疫组能有效诱导黏膜和体液产生特异性DPV IgG、IgA和IgM,且IgG和IgA在第6w达到高峰,IgM在第5w达到高峰,较对照组差异极显著(P<0.01)。同时,试验组pVAX1-LTB-UL24显著高于试验组pVAX1-UL24 (P<0.05),试验组SL7207(LTB-UL24)显著高于试验组SL7207(UL24) (P<0.05);试验组SL7207(LTB-UL24) 1×1011CFU免疫剂量组显著高于试验组SL7207(LTB-UL24) 1×109CFU免疫剂量组(P<0.05),和高于试验组SL7207(LTB-UL24) 1×1010CFU免疫剂量组。结果显示：鸭瘟病毒UL24基因疫苗具有良好的免疫原性,LTB基因具有良好的佐剂效应,以减毒沙门氏菌为载体的基因疫苗免疫原性与免疫剂量有关。5.鸭瘟病毒UL24基因疫苗免疫保护效果研究鸭瘟病毒UL24基因疫苗免疫后第6w,以1000 LD50 DPV强毒CHv株口服感染试验鸭,观察鸭死亡情况。结果表明：口服免疫组存活率较对照组显著提高,其中SL7207(LTB-UL24) 1×1011CFU达80%,高于肌注免疫组40%的存活率,且显著高于对照组10%的存活率(P<0.05)。研究显示：鸭瘟病毒UL24基因疫苗有一定的免疫保护效果。