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稻瘟病是最主要的水稻病害之一,由于稻瘟菌(Magnaporthe grisea)遗传背景复杂,生理小种易于变异,其防治一直是研究的重点和难点。近年来受到广泛关注的蛋白质组学研究,为从蛋白质水平揭示病原菌与植物相互作用的本质及寻求抗病防治措施提供了新的途径。本研究通过蛋白质组学技术,对稻瘟菌诱导水稻的蛋白质差异表达进行分析,拟从蛋白质整体水平上分析稻瘟菌诱导水稻的抗病性机理。
以广东稻瘟病菌优势小种之一 ZC13、抗稻瘟病近等基因系水稻C101LAC(含Pi—1t抗稻瘟病基因)及其背景品系CO39(不含已知抗病基因,感病对照)为材料,用稻瘟菌处理水稻后不同时间取样,经叶片总蛋白提取、双向电泳、图像分析、质谱鉴定,对稻瘟菌诱导后的水稻差异表达蛋白质进行鉴定和功能解析。结果如下:
1、对适合于水稻叶片功能蛋白质组分析的双相电泳体系的最佳条件进行了探索,结果表明:(1)使用改良的PEG—4000预沉淀法对水稻叶片总蛋白进行提取,可以有效减少色素和以Rubisco蛋白为主的高丰度蛋白,可以有效富集低丰度功能蛋白;(2)适合于该提取方法的蛋白等电聚焦条件:胶体考染蛋白上样量为550μg(银染蛋白上样量200μg)、聚焦时间Vhrs值为78,000、SDS-PAGE的凝胶浓度为12%时,获得了高分辨率的双向电泳图谱。
2、用稻瘟菌处理以CO39为背景的近等基因品系水稻,分别于8h、12 h、24 h、48 h、72 h后取样,经2—DE分离,PDquest8.0软件对2—DE图谱进行图像分析,获得了32个差异表达蛋白质。
3、采用MALDI-TOF-TOF质谱技术,对32个差异表达蛋白质进行了鉴定。结果表明,这32个差异表达蛋白质,除了一个功能能未知蛋白,按其功能可以分为6种类型,即代谢相关蛋白、信号转导相关蛋白、抗氧化相关蛋白、病程相关蛋白、调控相关蛋白和能量相关蛋白。
4、从蛋白质整体水平对水稻的抗瘟菌进行分析,与感病品系相比,抗病品系中差异表达蛋白质的种类不同、同一差异表达蛋白质的表达时间不同和表达量的差异,可能正是构成两个品系对稻瘟病抗性不同的原因。研究表明,水稻抗病品系较感病品系能更快速启动并大量表达与抗性相关的蛋白质(如快速启动乙烯信号途径、合成抗氧化类相关蛋白、病程相关蛋白等)。