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当前,随着人们对食品安全的越来越关注,利用微生物及其代谢物来防治果蔬采后病害成为其无害化防控的重要手段之一。目前,植物内生细菌及其活性代谢物在植物病害防治的研究与开发中越来越受到重视。为了开发内生细菌资源,获得果蔬采后病害防治方面具有生防价值的微生物,本论文以柑桔绿霉病菌为靶标,对越南槐的内生拮抗细菌及其抑菌成分进行了研究,主要涉及拮抗菌株的分离、筛选、菌种鉴定、拮抗菌株的生防效果及生防机制、发酵工艺优化、抑菌成分分离鉴定及抑菌成分的抑菌机制等研究,取得主要研究结果如下: (1)越南槐内生细菌的分离和活性菌株的筛选。对越南槐的内生细菌进行分离、纯化,得到139株内生细菌。试验证明越南槐的根、茎、叶以及种子中都存在内生细菌,其中根部分离纯化得到的内生细菌占绝大部分。选择9个拮抗菌株进行水果活体组织抑菌活性试验,结果表明,SG-6菌株的菌悬液和发酵滤液对柑桔绿霉病活体接种的抑制效果较好,发病率低于28.75%,抑菌谱试验表明SG-6菌株的抑菌谱较广。 (2)越南槐内生拮抗SG-6菌株的种类鉴定。通过BLAST分析SG-6菌16SrDNA序列。在GenBank通过同源性检索发现,SG-6菌株(GenBank登录号:HQ9021451与NCBI数据库中的其它多粘类芽孢杆菌菌株最接近,相似性为≥98%。在系统发育树中,SG-6与Paenibacillus polymyxa在同一分支上。Biolog系统鉴定显示,SG-6菌株与数据库中模式种P.polymyxa相比较,其可能性为99%,相似性为0.521,位距为4.60。根据形态特征、生理生化测定、16S rDNA序列分析和Biolog系统鉴定,所分离的SG-6菌株鉴定为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。 (3)多粘类芽孢杆菌SG-6菌株对柑桔绿霉病菌的抑制效果及生防机制研究。离体条件下,SG-6菌株能抑制柑桔绿霉病菌丝体生长和孢子萌发。在水果活体组织抑菌实验中,SG-6菌株的接菌浓度和接菌时间对防效的影响很大,浓度高,发病率越低,病斑直径越小。其中SG-6悬浮液以1×109 CFU·mL-1浓度处理柑桔绿霉病的发病率和病斑直径分别为18.31%和5.47mm,显著低于其它处理。SG-6菌株先于病原菌接种的抑病效果好于滞后接种,其中先于病原菌接种24h,发病率和病斑直径分别为8.33%和1.40mm。不同贮藏条件下,SG-6菌株均能明显降低柑桔绿霉病的自然发病率,且对果实重量,果实硬度,可溶固形物含量,可滴定酸含量等果实的品质指标没有影响。诱导系统抗性实验表明,果实接种多粘类芽孢杆菌SG-6后,其PPO、PPD和PAL酶等与抗性相关的酶活性提高。 (4)多粘类芽孢杆菌SG-6菌株发酵工艺优化。确定了最佳培养基组成及培养条件。响应面分析结果表明,SG-6菌株优化的发酵培养基配方为:马铃薯228.29 g·L-1、蔗糖38.14 g·L-1、硫酸铵8.63 g·L-1、K2HPO41.0 g·L-1、MgSO41.0 g·L-1、NaCl1.0 g·L-1、CaCO33.0 g·L-1。优化发酵培养基配方的发酵液对指示菌的抑菌圈直径比原始发酵培养基提高38.74%。SG-6菌株优化的发酵条件分别为:温度32℃、发酵时间52.6h、接种量12.13%、装液量77.67mL·250mL-1。采用优化发酵条件的发酵液对指示菌的抑菌圈直径比原始发酵条件提高10.31%。 (5)多粘类芽孢杆菌SG-6菌株抗菌物质的分离、纯化和鉴定。结合活性跟踪,通过硅胶柱层析、凝胶柱层析,制备型高效液相色谱分离正丁醇萃取物,得到3个活性组分A2-3-1、A2-3-2、A2-3-3。通过1H NMR、13C NMR、HSQC、HMBC波谱技术和MALDI-TOF-MS技术,对活性组分进行了结构解析,确定了其中4个化合物的结构,即确定样品A2-3-1主要由LI-F04a和LI-F04b组成,两者为相差一个亚甲基(CH2)的同系物。确定样品A2-3-3主要由LI-F08a和LI-F08b组成,两者同样为相差一个亚甲基(CH2)的同系物。样品A2-3-3中m/z为939.58的物质初步推断为LI-F型抗生素的新成员,其可能的分子式为:C45H82N10O11。样品A2-3-2则被推断为LI-F05或LI-F06型抗生素。 (6)多粘类芽孢杆菌SG-6菌株产LI-F类抗生素的抑菌机制。经SG-6菌株产LI-F类抗生素处理的柑桔绿霉病菌菌丝体产生节间变短,末端膨大,菌丝断裂等现象。SG-6菌株产LI-F类抗生素能作用于柑桔绿霉病菌细胞膜,导致细胞膜通透性增大;使柑桔绿霉病菌物质代谢异常,总糖含量增加,蛋白质、脂质、麦角甾醇含量减少;显著抑制线粒体NADH-Q脱氢酶活性,影响呼吸作用,最终造成柑桔绿霉病菌分解合成代谢失衡,引发病理现象。