第一部分：人微血管内皮细胞的分离、纯化、培养和鉴定 目的：建立人皮肤微血管内皮细胞的分离、纯化、培养和鉴定技术，为进一步建立体外血管新生三维模型奠定基础。方法：1，取人包皮组织，Dispase消化后分离细胞，EGM培养；2，免疫磁珠吸附法纯化内皮细胞；3，Ⅷ-因子相关抗原免疫组化染色进行纯度鉴定。结果：原代分离的内皮细胞中含有大量成纤维细胞污染，经免疫磁珠吸附法两次纯化后，内皮细胞纯度经Ⅷ-因子相关抗原免疫组化染色鉴定达到99％以上；人微血管内皮细胞在单层培养时呈典型的“铺路石”样，并具有体外成血管特性。结论：成功建立了人皮肤微血管内皮细胞的分离、纯化、培养及鉴定技术。获取的内皮细胞纯度高、体外增殖速度快，可进一步用于血管新生体外模型的构建及相关研究。 第二部分：三维血管新生模型的构建及血清的影响目的：构建基于微载体、人皮肤微血管内皮细胞的体外血管新生三维模型，摸索适于该模型系统的血清及其浓度。方法：1，将人皮肤微血管内皮细胞包被于微载体(Cytodex-3)；2，将包被有内皮细胞的微载体包埋于由培养液配制的三维纤维蛋白凝胶中(1.0mg/ml)；3，为研究血清在模型构建中的作用，在培养体系中分别添加不同浓度的胎牛血清(FBS)和成人血清(HS)，bFGF浓度固定为20ng/ml。实验分为对照组(不含血清)，1％、2％、5％、10％、20％FBS组及1％、2％、5％、10％、20％HS组。4，为观察促血管新生因子bFGF的体外促血管新生效应，在培养体系中分别添加不同浓度的bFGF，血清固定为5％HS。实验分为对照组、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml和40ng/mlbFGF组。5，测量毛细血管样结构(capillary-likestructure，CLS)长度，比较每个微载体的平均毛细血管样出芽长度(averagelengthofcapillary-likesprouts，ALS)。结果：1，内皮细胞与微载体混合培养4小时后，即充分贴附于微载体上；经过24～48小时的培养，内皮细胞基本铺满微载体；2，各FBS组仅见少量内皮细胞向基质迁移、出芽，无类管腔结构和毛细血管样网络形成。成人血清组见包被在微载体上的内皮细胞侵入三维纤维蛋白基质，形成“出芽”状结构，后者不断延长，形成具有内腔的毛细血管样结构。在模型构建后24小时、48小时和72小时，在1％～5％HS浓度范围内，CLS长度与HS浓度呈正相关，而10％HS组、20％HS组与5％HS组比较，无显著性差异(P＞0.05)；4，在模型构建后24小时，10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml和40ng/mlbFGF组的ALS分别为：34.25±14.01μm、61.63±24.73μm、100.25±31.06μm和124.25±28.72μm，而对照组为5.63±3.34μm。各实验组和对照组比较有显著性差异(P＜0.01)。随着作用时间的延长，这种差异也更为显著。在10ng/ml～40ng/mlbFGF浓度范围内，该模型下的体外血管新生表现为bFGF剂量依赖性。结论：成功构建了基于人微血管内皮细胞、微载体的体外血管新生三维模型，确定5％HS为模型构建的合适血清浓度。该模型可反映内皮细胞向基质中迁移、出芽，形成类管腔结构、分枝以及毛细血管网络等体内血管新生的特征性过程，且便于定量，适用于评估新生血管活性物质。