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背景与目的：
内皮损伤是动脉粥样硬化性疾病发生、发展的关键，近年研究发现，血管内皮的修复除了靠损伤边缘的内皮细胞增殖，骨髓起源的内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)通过动员、归巢到血管损伤部位并增殖分化为内皮细胞，并通过旁分泌方式分泌各种细胞生长因子参与缺血组织的血管新生和侧支形成。外周血EPCs数量和功能与心血管危险因素呈负相关，外周血EPCs水平是冠心病人发生心血管事件的独立预测因子。糖基化终产物(advancedglycation end products，AGEs)是还原糖与蛋白质在非酶促条件下自发生成的一大类物质，可引起成熟内皮细胞功能障碍并加速动脉粥样硬化的进程。循环和组织中AGEs水平随年龄增长缓慢增加，在糖尿病、慢性肾脏病需要透析治疗病人体内异常升高。流行病学调查结果显示，糖尿病血管并发症是糖尿病病人致死致残的主要原因。糖尿病病人易患动脉粥样硬化性疾病，尤其易发生心肌梗死、缺血性脑卒中等血栓栓塞事件且临床预后差，这在很大程度上与血管内皮损伤严重和缺血组织血管新生障碍有关，其中具体机制目前仍未清楚，关于AGEs对EPCs功能的影响目前鲜有文献报道。本研究目的：观察与糖尿病病人血清浓度类似的AGEs是否抑制体外培养EPCs的功能并探讨可能机制。
方法：
1．牛血清白蛋白(BSA，low endotoxin)和高浓度葡萄糖在密封无菌、无酶的条件下，经过12周37℃避光孵育后，透析除去未结合的葡萄糖，获得AGEs—BSA。利用三硝基苯磺酸(TNBS)法测定蛋白样品中游离氨基数、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)测定蛋白样品分子量，验证BSA已被修饰并形成分子量不均一的混合物。采用竞争法酶联免疫吸附试验(ELISA)测定体外孵育AGEs—BSA及糖尿病病人及健康成人血清中AGEs浓度。
2．分离脐血中单个核细胞，接种于明胶包被的培养瓶中，利用差速贴壁法，留取48 h后贴壁细胞，用EGM-2-MV(Clonetics公司)完全培养液诱导分化。倒置显微镜下观察贴壁细胞生长情况，第10～15 d时，采用流式细胞术检测CD45、CD146、CD105表达情况，免疫细胞化学染色检测vWF表达情况；检测其摄取DiI标记乙酰化低密度脂蛋白(DiI-ac—LDL)及结合FITC标记荆豆凝集素(FITC—UEA-1)的能力，明确所培养贴壁细胞为EPCs。
3．用相当于糖尿病病人血清中浓度的AGEs—BSA与EPCs共培养24 h，利用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖能力；Annexin V/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡；Boyden小室法检测血管内皮生长因子(VEGF)趋化的细胞迁移能力；以及在细胞外基质(ECMatrix gel)上形成毛细血管样网状结构的能力。
4．利用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)检测AGEs受体(RAGE)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)mRNA水平；蛋白免疫印迹法(Western blotting)测定RAGE、eNOS、环氧化酶-2(COX-2)、Akt蛋白表达水平。
5．将抗RAGE抗体与AGEs及EPCs共培养24 h后，检测细胞凋亡、迁移、形成毛细血管样网状结构的能力以及EPCs中RAGE、eNOS、COX-2、Akt蛋白表达水平。
结果：
1．BSA在体外发生非酶促糖基化修饰形成AGEs—BSA，糖尿病病人血清中AGEs浓度明显高于健康成人。
2．脐血单个核细胞在体外培养过程中先后出现两种细胞：第5～7 d出现的集落样生长细胞，扩增不明显，存在约14 d左右即消失；培养10～15 d时，逐渐出现约20～50个细胞组成的细胞簇，约1～3 d即可形成大于500个细胞细胞簇，细胞呈铺路石样。大于95％的细胞免疫表型为CD45—/CD146+/CD105+，表达vWF，可摄取ac—LDL并与UEA-1结合。
3．在与糖尿病人血清浓度类似的AGEs—BSA与EPCs共培养24 h后，EPCs凋亡增加、VEGF诱导的迁移及在细胞外基质上形成新生血管的能力下降，增殖能力尚未观察到有显著变化。RAGE mRNA和蛋白表达均增加，eNOS mRNA水平和蛋白表达均不受影响，MMP-2 rnRNA减少，Akt及COX-2蛋白表达减少。
4．将抗RAGE抗体与AGEs及EPCs共培养24 h后，与单独使用AGEs与EPCs共培养相比，EPCs凋亡减少、迁移和体外形成新生血管能力恢复；RAGE表达明显减少、COX-2和Akt表达增加、eNOS表达无明显改变。
结论：
1．AGEs可促进EPCs凋亡、抑制VEGF诱导的EPCs迁移、降低EPCs形成新生血管的能力；使EPCs细胞膜表面AGEs的受体RAGE表达增加。
2．AGEs通过减少EPCs中Akt、COX-2及MMP-2表达引起EPCs凋亡增加、VEGF诱导的迁移减少及形成新生血管的能力下降。这些作用通过或至少部分通过AGEs与RAGE结合后产生，可被抗RAGE抗体部分或全部阻断。有关AGEs引起脐血来源EPCs中与血管新生相关的COX-2以及MMP-2表达水平降低为首次报道。