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背景与目的：近年研究表明，脏器组织供血动脉发生闭塞后缺血组织血管新生、侧支形成不仅依赖于原位血管的芽生，骨髓起源的内皮祖细胞(endothelialprogenitor cells，EPCs)也积极参与了这一过程。糖尿病病人发生动脉硬化血栓栓塞事件如心肌梗死、缺血性脑卒中后临床预后往往更差，这在很大程度上与缺血组织血管新生障碍有关，然而导致这一异常的具体机制目前仍未清楚。本研究目的即：1．观察糖尿病动物基础状态下外周血EPCs数量是否减少，并探讨其可能机制；2．观察糖尿病动物组织缺血诱导的骨髓EPCs动员是否存在障碍，并探讨其可能机制。
方法：1．链脲霉素(streptozotocin，STZ)腹腔注射法诱导雄性C57BL/6小鼠糖尿病，非糖尿病对照组给予等量缓冲液。饲养10周后，进行左侧股动脉高位结扎离断术造成单侧后肢缺血模型，通过组织切片苏木素—伊红(hematoxylin &eosin，H&E)染色法、红四氮唑(2，3，4-triphenyltetrazolium chloride dye，TTC)染色法与后肢血管造影确定造模成功。2．利用CD31免疫组化染色从形态学上评估股动脉结扎术后7 d及14 d小鼠双后肢血管新生情况；动态监测双后肢经皮氧分压(transcutaneous oxygen pressure，tcpO2)变化从功能上评估缺血组织微循环恢复情况。3．采用流式细胞术检测基础状态下(股动脉结扎术前)血浆内皮微粒(endothelial microparticles，EMPs)与外周血EPCs数量，并动态监测术后不同时间循环中早期EPCs数量变化。酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbentassay，ELISA)法测定相应时间点血浆中血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)水平。蛋白免疫印迹法测定相应时间点双后肢腓肠肌组织中VEGF、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)2和9以及MMPs的组织抑制子(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase，TIMP)-1表达水平。4．以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein EGFP)转基因雄鼠为供体、C57BL/6雄鼠为受体建立骨髓移植模型，2周后同前造成糖尿病模型，利用流式细胞术及荧光显微镜术监测移植鼠骨髓重建水平，小鼠饲养16周后，利用共聚焦显微镜观察主动脉内膜自发损伤修复情况。5．为了研究STZ是否对EPC有直接作用，我们还分离培养C57BL/6雄鼠骨髓EPCs，通过细胞形态学特征及流式细胞术鉴定其表型，以不同浓度梯度STZ干预，利用流式细胞术检测EPCs的增殖及凋亡水平。
结果：1．在基础状态下，与非糖尿病对照组比较，糖尿病小鼠外周血EPCs数量明显减少，而血浆EMPs显著增多，并且两者呈负相关。2．在EGFP转基因小鼠骨髓移植模型中，糖尿病小鼠主动脉内膜上由移植骨髓来源的EGFP+内皮细胞增多。3．在单侧后肢缺血后，与非糖尿病对照组比较，糖尿病小鼠骨髓EPCs动员障碍，动员高峰期外周血早期EPCs数量减少，并伴随着缺血组织血管新生减少、微循环恢复受阻。4．与非糖尿病对照组比较，糖尿病小鼠缺血诱导的血浆VEGF释放以及组织VEGF表达上调受抑，而缺血组织MMP—9、MMP-2表达增加，TIMP-1表达减少，MMP/TIMP系统调节异常。单变量回归分析表明，血浆及组织VEGF水平与外周血EPCs数量呈正相关，组织MMP—9表达水平与外周血EPCs数量呈负相关，而组织MMP-2、TIMP-1表达水平与外周血EPCs数量无显著相关性；多元逐步回归分析表明，只有组织VEGF水平与外周血EPCs独立相关。5．体外细胞干预试验显示，与小鼠循环浓度相当的STZ并不影响骨髓EPCs的增殖与凋亡。
结论：1．内皮细胞损伤加速导致EPCs消耗性减少，可能是基础状态下糖尿病外周血EPCs数量降低的重要机制。2．组织缺血后骨髓EPCs动员减少是糖尿病缺血组织血管新生障碍的新机制，而缺血诱导的VEGF上调受抑可能介导了这一病理过程。