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随着我国水产养殖业集约化、高密度化的发展,抗生素及化学药物在养殖过程中大量使用,严重影响了水产品的安全。因而迫切需要发展新的无公害的预防和治疗鱼病的药物。先天免疫在鱼类抵抗病原体过程中发挥重要作用,抗菌肽是先天免疫系统的重要成分,对其研究具有重要意义。
本文从斜带石斑鱼白细胞cDNA文库中扩增获得两个抗菌肽的cDNA序列,命名为Epinecidin1l和2。Epinecidin—1编码67个氨基酸残基的多肽,推测其包括22个氨基酸残基的信号肽,25个氨基酸残基的成熟肽和20个氨基酸残基的C端肽;Epinecidin—2编码71个氨基酸残基的多肽,推测其包括22个氨基酸残基的信号肽,23个氨基酸残基的成熟肽和26个氨基酸残基的C端肽。
经PCR和反向PCR方法扩增获得这两个基因的全序列,发现它们均含4个外显子和3个内含子。用磷酸缓冲液和β—葡聚糖分别注射石斑鱼,并用半定量RT—PCR方法测定各组织中Epinecidin—1的表达,结果表明Epinecidin—1的转录水平在注射8h后表达量上升,在24h达到高峰,后逐渐下降至正常水平。但注射β—葡聚糖和磷酸缓冲液两组无明显差异。提示Epinecidin—1表达变化可能是由注射因素引起,不受到Toll途径的调控。
化学合成了Epinecidin—1和2的成熟肽(分别为25肽和23肽),并进行C端酰胺化。测定了此两个抗菌肽对多种水产菌的杀菌谱和最低杀菌浓度。结果表明,它们对常见的水产病原菌如副溶血弧菌、溶藻弧菌、多杀性巴斯德杆菌、摩根尔摩根菌、温和气单胞菌、创伤弧菌、美人鱼弧菌、脑膜脓毒性黄杆菌、嗜水气单胞菌等有很强的杀灭能力(最低杀菌浓度低于5μM),提示石斑鱼抗菌肽可能用于水产养殖业,预防和治疗养殖鱼类的细菌感染,减少抗生素和化学药物的使用。
为研究水生动物重要病毒与宿主的相互作用,构建了传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)感染鳜,以及白斑综合症病毒(WSSV)感染敏感凡纳滨对虾和抗性儿纳滨对虾的抑制性消减杂交cDNA文库,为后续的相关研究打下了基础。