颅脑损伤是法医实践工作中最常见的损伤之一，在暴力性死亡中占首要位置。研究表明，细胞凋亡在脑损伤后神经元继发性损伤过程中扮演着重要角色。神经细胞发生凋亡的机制复杂多样，创伤后的各种刺激信号可通过多种途径诱导凋亡的发生，同时涉及多种病理生理因子的表达。近年来，虽然有很多学者对神经细胞凋亡进行了大量的研究，但总的来说，目前对其发生的具体机制和途径还不完全清楚。 微小RNA(microRNA)是新近发现的一类长度约为18～25nt的非编码RNA，它们可以通过与特定mRNA结合或调节特定mRNA的蛋白质翻译过程来调控基因表达，广泛参与发育、神经分化、细胞增殖、凋亡和脂肪代谢等生理过程，是细胞增殖分化和生物体发育过程中重要的调节因子。目前关于miRNA在脑损伤后神经细胞凋亡中的作用机制研究较少，其是否参与神经细胞凋亡的调控及作用机制如何有待进一步研究。 在过氧化氢(H2O2)诱导PC12细胞损伤模拟神经细胞氧化应激损伤实验中，基因芯片筛选发现凋亡细胞中miR-422a的表达显著下调，而查阅miRNA靶基因数据库发现其靶基因之-bcl-w属凋亡相关基因bcl-2家族成员，意味着miR-422a可能参与了细胞凋亡的调控。本实验拟在前人研究的基础上，运用实时定量PCR检测不同程度凋亡细胞中miR-422a的表达水平，并通过western blot方法检测bcl—w蛋白的表达情况，探讨miR-422a参与调控细胞凋亡的作用机制，以期为脑损伤后神经细胞凋亡的机制研究提供理论参考，为颅脑损伤法医学鉴定提供新的思路。 实验目的：采用H2O2诱导PC12细胞凋亡，检测不同程度凋亡的PCI2细胞中miR-422a及bcl—w蛋白的表达水平，探讨miR-422a参与细胞凋亡调控的作用机制。 实验方法： 培养PC12细胞，以0nmol／L浓度组作为对照，分别用30nmol／L、50nmol／L、100nmol／L、200nmol／L、300nmol／L和400nmol／L的H2O2处理12h。收集处理好的细胞采用流式细胞仪检测其凋亡率，运用实时定量PCR检测不同浓度组细胞中miR-422a表达水平，并用western-blot技术检测bcl—w蛋白的表达情况。 实验结果： 1、流式细胞仪分析细胞凋亡率结果 30nmol／L、50nmol／L、100nmol／L、200nmol／L、300nmol／L和400nmol／L的H2O2处理12小时后的PCI2细胞凋亡率分别为1.7±0.2％、9.8±0.4％、21.9±0.7％、38.0±0.4％、36.4±0.8％和37.8+0.3％。除30nmol／L浓度组外，其它组的凋亡率与对照组凋亡率1.3±0.2％相比均有统计学意义(P<0.05)。 2、实时定量PCR检测结果 30nmol／L、50nmol／L、100nmol／L、200nmol／L、300nmol／L和400nmol／L的H2O2处理12小时后的PC12细胞中miR-422a表达量降低，除30nml／L组外与对照组相比均有统计学意义(p<0.05)，表达量总体呈降低趋势。 3、Western blot结果 30nmol／L、50nmol／L、100nmol／L、200nmol／L、300nmol／L和400nmol／L的H2O2处理12小时后的PC12细胞中bcl—w蛋白的表达量升高，30nml／L浓度组与对照组相比无有统计学意义(P>0.05)，50nmol／L、100nmol／L、200nmol／L、300nmol／L和400nmol／L浓度组与对照组相比均有统计学意义(P<0.05)。 4、miR-422a与bcl-w蛋白表达量相关性分析 结果显示两者负相关，相关系数为-0.95，有较强相关性。 结论： 1、以不同浓度的过氧化氢(H2O2)诱导PC12细胞凋亡，成功构建了细胞凋亡模型。 2、在H2O2诱导PC12细胞凋亡模型中，随PC12细胞凋亡率的升高，miR-422a的表达量降低，bcl-w蛋白的表达量升高。 3、在H2O2细胞诱导凋亡PC12细胞中，miR-422a与bcl-w蛋白表达量负相关，miR-422a可能通过作用于bcl-w参与细胞凋亡的调控。