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目的:采用UPLC建立复方丹参片中丹参七个不同提取工艺的化学指纹图谱,并对丹参七个提取工艺所得提取物进行小鼠抗心肌缺血药效研究;通过灰色关联度法赋予各指纹峰药效信息,横向与纵向综合比较七个工艺峰效归属结果,初步构建丹参抗心肌缺血的“谱效”模型。基于“谱效”关系构建丹参提取工艺的评价指标,为更符合中医药理论评价中药提取工艺奠定实验基础。 方法:1.丹参样品制备以2015版《中国药典》复方丹参片中丹参的制备工艺为基础,优化色谱条件,建立了丹参饮片七个不同提取工艺(①95%乙醇回流提取1.5h;②50%乙醇回流提取1.5h;③蒸馏水回流提取2h;④95%乙醇回流提取1.5h+50%乙醇回流提取1.5h;⑤95%乙醇回流提取1.5h+蒸馏水回流提取2h;⑥50%乙醇回流提取1.5h+蒸馏水回流提取2h;⑦95%乙醇回流提取1.5h+50%乙醇回流提取1.5h+蒸馏水回流提取2h)的化学指纹图谱。 2.以七个工艺所得提取物进行小鼠抗心肌缺血药效研究,其药效指标主要包括生理指标:心率、T波、ST段;生化指标:丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)和病理状态(HE染色后电镜下观察心肌细胞损伤情况),得到丹参七个提取工艺下的小鼠抗心肌缺血药效信息。 3.通过灰色关联度法评价出最佳工艺结果并归属出七个工艺中各个峰对药效的贡献率大小,初步构建丹参抗心肌缺血的“谱效”模型。 4.结合本试验研究结果与丹参相关的文献研究结果,采用L9(34)正交试验综合评分法,优选出复方丹参片用于治疗心肌缺血的丹参最佳提取工艺。 结果:1.确定七个工艺的色谱条件:色谱柱:ACQUITY UPLC(@)BEH shield RP181.7μm,2.1×50mm Column;柱温:30℃;流速:0.3ml.min-1;检测波长270nm;进样量1μL;流动相:0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脱,洗脱程序为:0~5min:85~75(A);5~8min:75~58(A);8~19min:58~42min(A);19~20min:42~85(A)。 2.建立了复方丹参片中丹参的七个提取工艺UPLC指纹图谱,确定共有峰并进行了分析和归属。通过比较了七个工艺的色谱图标定14个峰作为共有峰,其中工艺一(95%醇提物)和工艺七(95%醇提+50%醇提+蒸馏水提混合物)标定了14个峰,工艺二(50%醇提物)、工艺四(95%醇提物+50%醇提混合物)和工艺五(95%醇提+蒸馏水混合物)标定了13个峰,工艺三(蒸馏水提物)标定7个峰,工艺六(50%醇提+蒸馏水提混合物)标定了10个峰。比较了七个工艺的14个峰的含量发现工艺一中的7号峰(丹酚酸B)的含量最低,11号峰(隐丹参酮)、12号峰(丹参酮Ⅰ)、13号峰(丹参酮ⅡA)的含量相对于其他六个工艺的含量高,且工艺三中几乎检测不到这几种脂溶性成分。 3.由聚类结果可知,丹参作为一种含有脂溶性成分和水溶性成分的药材,在提取过程中采用不同的提取溶剂对其成分的种类和含量都有影响,对七个工艺进行聚类发现,与只有一次提取的聚类结果相比,涉及两次及两次以上提取物合并的其聚类结果差异较大,故在对药材进行聚类分析时不建议使用多次提取的混合物进行。 4.丹参抗心肌缺血药效结果显示,七个工艺给药组在不同时间段对心率、ST段、T波这三个指标有抑制作用,但抑制作用较弱。七个工艺能降低反应自由基MDA水平,降低CK的升高,减少内皮细胞的损伤,抑制血栓的形成,减轻生物膜的损伤。心肌病理组织切片结果表明,两个样本(S2号样和S11号样)的工艺2、工艺3、工艺6、工艺7均能一定程度的减轻心肌病变的程度,但与阳性组比较治疗效果较弱。 5.本实验基于灰色关联度对七个工艺的药效分析得出,基于灰色关联度对丹参的工艺评价结果和药效试验结果基本一致,说明灰色关联度可以作为提取工艺优选的一种计算方法。基于优选出来的工艺中峰的贡献率计算,结果说明在治疗抗心肌缺血疾病中以13号峰(丹参酮ⅡA)、14号峰、1号峰(丹参素钠)的贡献率最大,且丹参酮ⅡA为丹参中脂溶性成分代表之一,丹参素钠为丹参中水溶性成分代表之一。说明丹参在治疗抗心肌缺血疾病时,是其水溶性成分和脂溶性成分共同作用的结果,且脂溶性成分贡献率大于水溶性成分。 6.以乙醇浓度(A)、提取次数(B)、提取时间(C)和容媒用量(D)四个因素为代表设计L9(34)正交试验,采用综合评分法优选出以丹参酮ⅡA和丹参素钠为评价指标的丹参治疗心肌缺血的提取工艺优选,优选出最佳工艺为A1B1C1D3,即12倍量85%的乙醇回流提取1次,每次0.5h。 结论:基于灰色关联度建立的谱效关系可以用来评价其药物的提取工艺优劣,但其药物中各成分是综合发挥药效的,故对工艺所得成分对药效的贡献率大小及量效关系该如何确定有待进一步研究。