目的：在工业化国家中，心血管疾病是发病率、死亡率和致残率高的首要原因。血管内皮细胞功能障碍与心血管疾病的发生发展密切相关。在病理因素刺激下，以内皮依赖性血管舒张功能下降、血管通透性增加、炎症反应、内皮细胞脱落等为主要表现的血管内皮功能障碍是诸多循环系统疾病如高血压、动脉粥样硬化、糖尿病血管病变、肾病等的始动因素及共同的病理基础，而这一系列的病理改变均与内皮细胞合成的NO不足或其生物利用度降低有关。合成NO的限速酶eNOS的活性调控涉及复杂的模式及调控机制。本研究的目的是依据活性导向的原则，从中药乙醇提取物及相关单体成分中筛选出通过NO-cGMP通路舒张血管的药物并深入探讨其机制，以及活性成分对AngⅡ诱导的内皮细胞中eNOS功能损伤的细胞病理模型的干预作用。　　 方法：第一部分：　　 1.以雄性SD大鼠离体胸主动脉为研究载体，利用Power Lab血管功能评价系统对中药乙醇提取物及相关的单体成分进行具有内皮依赖性舒张血管活性的药物筛选，以50％乙醇溶解中药乙醇提取物，以双蒸水溶解中药水提取物，以DMSO溶解中药相关的单体化合物。以等比的方式从高到低设置5个浓度梯度点，中药乙醇提取物最大浓度为10-3g/ml;最小浓度为10-7g/ml:单体成分最大浓度为10-5mol/L;最小浓度为10-9mol/L。用106mol/L去氧肾上腺素(PE)预收缩血管环，待收缩达坪值后逐步累积加入中药提取物溶液或相关的单体工作液，最后以10-6mol/LForskolin引起的舒张作为100%舒张，记录浓度舒张曲线，以药物介导的血管最大舒张率超过50%为标准，进行药物筛选。　　 2.以雄性SD大鼠离体胸主动脉为研究对象，应用NOS阻断剂L-NAME、sGC阻断剂ODQ和COX抑制剂Indomethacin在离体器官水平对第一次筛选得到的具有舒张血管活性的中药及相关单体进行血管舒张作用的机制探讨。　　 3.以培养的人脐静脉内皮细胞(HUV ECs)为研究对象，用不同浓度的中药乙醇提取物孵育24hrs，应用改良的Griess法检测细胞培养上清液中亚硝酸盐的含量，间接反映药物对内皮细胞产生NO的影响；用荧光探针DAF-FM DA检测中药及相关单体不同浓度孵育20min对细胞内NO水平的影响。　　 4.给予HUVECsα-细辛醚10-5mol/L分别处理6，12，24hrs，用PCR和Western blot技术考察α-细辛醚对HUVEC中eNOS mRNA水平和总蛋白表达的影响；给予HUVECs不同浓度和时间的α-细辛醚干预，用Western blot技术考察α-细辛醚对HUEVCs中eNOSSer1177和Thr495磷酸化表达的影响：应用含EGTA的无钙磷酸盐缓冲液(PBS)和不同的蛋白酶抑制剂预处理HUVECs30min，再给予α-细辛醚10-5mol/L处理，探讨α-细辛醚诱导eNOS磷酸化的细胞内信号转导通路及相互之间的关系。　　 第二部分：　　 1.以雄性SD大鼠离体胸主动脉为研究对象，利用Power Lab血管功能评价系统对8种中药相关的单体成分进行了抑制AngⅡ介导的血管收缩活性的筛选。　　 2.以HUVECs为研究载体，给予AngⅡ10-7mol/L孵育24hrs，用荧光探针DHE和DAF-FM DA检测细胞内的O·-和NO水平，并对8个中药和8个单体进行了干预作用的筛选。　　 3.以EA.hy926细胞为研究对象，给予AngⅡ10-7mol/L孵育24hrs，再给予ACh10-5mol/L处理0～60min，用Western blot技术检测eNOS Ser1177磷酸化水平，建立内皮细胞功能损伤的病理模型；用α-细辛醚10-5mol/L预处理1h，给予AngⅡ+α-细辛醚孵育24hrs，再给予ACh10-5 mol/L处理0～60min，用Western blot技术检测eNOS Ser1177磷酸化水平，探讨α-细辛醚的干预作用。　　 4.采用MTT法考察了α-细辛醚1～100μmol/L孵育24hrs对EA.hy926细胞增殖能力的影响。　　 结果：第一部分：　　 1.中药乙醇提取物石菖蒲、赤芍、白芍、制白附子、丹皮、当归、檀香及葛根均以浓度依赖的方式介导PE预收缩的SD大鼠离体胸主动脉环的舒张，且能够部分或完全被NOS阻断剂L-NAME和sGC阻断剂ODQ所阻断，但均不能被COX阻断剂吲哚美辛阻断，提示这些药物具有部分或完全的内皮依赖性舒张血管活性，作用机制和NO-cGMP有关。单体成分中以α-细辛醚、氧化苦参碱和丹皮酚舒张血管活性较好，接近于50%;本研究首次发现α-细辛醚和β-细辛醚的舒张血管活性有显著性差异，以α-细辛醚活性较好，在10-9～10-5mol/L浓度范围内有良好的线性关系，Emax为42.64±11.89%，EC50为3.41×10-5mol/L，且可以被NOS阻断剂L-NAME和sGC的阻断剂ODQ阻断，提示其内皮依赖性的舒张血管活性是通过NO-cGMP通路实现的。　　 2.中药乙醇提取物石菖蒲、赤芍、白芍、制白附子、丹皮、当归、葛根和檀香均可以不同程度地上调内皮细胞HUVECs培养上清液中亚硝酸盐的含量，提示能促进内皮细胞分泌NO；其中石菖蒲和赤芍在0.025～0.1g/L的浓度范围具有良好的浓度依赖性，Emax分别达到25.42±0.99和26.36±1.37μmol/L，经统计学分析，与对照组比较均为p＜0.01，有极显著性差异。单体α-细辛醚在10-5mol/L的浓度可以显著提高HUVECs培养上清液中亚硝酸盐的含量，与前期血管环研究结果一致。采用荧光探针DAF-FM DA检测细胞内的NO水平，实验结果提示，中药乙醇提取物均可以不同程度地刺激细胞内NO生成；单体α-细辛醚和仙茅苷、何首乌苷可以上调细胞内的NO水平。　　 3.给予HUVECsα-细辛醚10-5mol/L分别处理6,12，24hrs，对eNOS mRNA水平和总蛋白表达无显著影响，提示α-细辛醚上调内皮细胞中NO水平的机制可能与eNOS的转录前调控无关。但是α-细辛醚以时间和浓度依赖的方式上调eNOS Ser1177的磷酸化水平，最佳浓度是10-5mol/L，Emax达4.61±0.62（Fold of control），同时伴随eNOS Thr495磷酸化的下调。相关的分子机制的研究表明，α-细辛醚上调eNOS Ser1177的磷酸化水平是钙离子依赖的；并通过P13K/Akt，p38MAPK和ERK1/2MAPK三条细胞内信号转导通路实现。　　 第二部分：　　 1.对8个单体进行了抑制AngⅡ介导的血管收缩活性的筛选，发现除丹皮酚外，各单体在较高浓度AngⅡ（10-7mol/L和10mol/L）均有一定抑制AngⅡ介导的血管收缩的活性，其中以α-细辛醚效果最佳，在AngⅡ10-7和106mol/L都有显著差异(p＜0.01和p＜0.05)，Imax为61.53±10.58%，提示α-细辛醚具有抑制AngⅡ介导的血管收缩的活性。相对而言，β-细辛醚的活性较差，Imax为25.87±2.4%，经统计学分析，在AngⅡ10-7mol/L浓度，p＜0.05，二者差异有统计学意义。提示在该活性方面，二者可能存在构效关系。　　 2.中药乙醇提取物及相关单体在较高浓度都可以不同程度地抑制AngⅡ(100nmol/L)诱导的细胞内超氧阴离子水平的升高，同时可以上调细胞内的NO水平，提示这些中药有可能通过其抗氧化活性发挥对内皮功能障碍的保护作用。如石菖蒲及其主要活性成分α-细辛醚和β-细辛醚均以浓度依赖性的方式抑制AngⅡ诱导的细胞内O2的升高，Imax分别为62.96±2.52%(100μgml)，116.77±13.18%（100μmol/L），88.75±14.47%(100μmol/L)。细胞内NO水平的检测结果提示，三者均可以上调AngⅡ诱导的细胞内NO水平的下降，Em分别为72.54±23.79%(100μg/ml)，61.70±13.27%(100μmol/L)和41.71±8.05%(100μmol/L)，经统计学分析，与模型组比较，均为p＜0.01，有极显著性差异；但是石菖蒲乙醇提取物和α-细辛醚对NO的上调效果具有优于另一活性成分β-细辛醚的趋势。　　 3.在内皮细胞EA.hy926，给予ACh(10-5mol/L)刺激不同时间(0～60min)，可以上调eNOS Ser1177位点的磷酸化，而且呈双峰型表达，2min显著增加，随后则急剧下降，然后缓慢上升，于30min达第二个峰值。AngⅡ(10-7mol/L)孵育EA.hy926细胞24hrs后再给予ACh(10-5mol/L)刺激，eNOS总蛋白无明显改变，但eNOS Ser1177磷酸化蛋白的时间曲线明显消失，显著降低，与正常对照组相比，差异具有统计学意义。预先给予α-细辛醚（10-5mol/L）预处理1h后，再给予AngⅡ孵育24hrs，然后再给予ACh刺激0～60min，eNOS Ser1177磷酸化蛋白表达有所回升，时间曲线接近正常对照组，经统计学分析，与模型组比较，p＜0.05，有显著性差异。　　 4.EA.hy926细胞给予α-细辛醚不同浓度孵育24hrs后，细胞增殖能力和正常对照组相比（105～114.5%vs.control）无显著性差异，提示α-细辛醚在此浓度范围内处理EA.hy926细胞24hrs，对细胞增殖能力无影响。　　 结论：　　 1.中药乙醇提取物石菖蒲、赤芍、白芍、制白附子、丹皮、当归、檀香和葛根均能以浓度依赖和内皮依赖的方式舒张血管，机制和NO-cGMP有关。　　 2.单体α-细辛醚通过NO-cGMP途径舒张大鼠离体胸主动脉，相关的细胞内的分子机制为上调内皮细胞分泌NO的水平，该作用是通过促进内皮细胞中eNOS Ser1177磷酸化水平而上调eNOS的活性实现的，α-细辛醚上调eNOS Ser1177磷酸化水平为钙离子依赖性的，细胞内的信号转导通路是通过同时上调P13 K/Akt、p38MAPK和ERK1/2的活性而实现的。　　 3.α-细辛醚具有抑制AngⅡ介导的血管收缩的活性。在内皮细胞，α-细辛醚(10-5mol/L)预处理1h可以拮抗AngⅡ(10-7mol/L)诱导的内皮细胞eNOS Ser1177磷酸化不足，因而可以保护AngⅡ(10-7mol/L)诱导的内皮细胞功能损伤。　　 4.经采用MTT法考察，α-细辛醚在100μmol/L以内与内皮细胞共孵育24hrs对细胞的增殖能力无影响。