论文部分内容阅读
多拉菌素(doramectin)是阿维菌素(avermectin)第三代衍生物，由阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)的α-酮酸脱氢酶(BCDH)阻断突变株经突变生物合成获得，化学本质为一种大环内酯类抗生素。与其它大环内酯类抗生素不同，其生物学活性主要表现为高效驱杀动物体内外寄生虫。多拉菌素比其它阿维菌素类药物具有更高的杀虫活性和更久的持效时间，被认为是最具有开发潜力的广谱抗寄生虫新药。 本研究通过同源双交换法成功地对bkdFGH基因簇进行缺失，构建获得了阿维菌素前体合成阻断突变株LZ-01。该突变株无法合成阿维菌素，在发酵过程中添加环己羧酸钠作为前体，发酵产物经HPLC检测，获得未知组分1，其出峰时间与多拉菌素标准品一致，可初步认定为多拉菌素(CHC-B1)。aveD基因编码的C5-O-甲基转移酶介导了阿维菌素“B”组分向“A”组分的转化。本研究通过同源双交换法，以突变株LZ-01做为出发菌株，对aveD进行缺失，构建了阿维链霉菌aveD基因缺失突变株LZ-02。该突变株在发酵过程中添加外源前体环己羧酸钠，经HPLC检测仍可合成未知组分1，但已经不再产生CHC-A组分。发酵产物中未知组分1经LC/MS检测确认为多拉菌素。aveC基因是阿维链霉菌生物合成基因簇中非常重要的基因，研究表明其参与了多拉菌素“2”组分向“1”组分的转化。本研究通过全基因合成带有10个突变位点(包括D48E和E238D)的aveC*基因，以LZ-02做为出发菌株，构建获得了aveC*基因过表达突变株LZ-03。该突变株的发酵产物中多拉菌素(CHC-B1)与CHC-B2产量比例基本未改变，但两者的总产量有显著提高。以突变株LZ-01、LZ-02作为出发菌株，对多拉菌素的发酵条件进行了优化。结果表明:多拉菌素最佳的发酵时间为311h(约13d)，发酵培养基以棉籽粉和豆粕作为复合氮源最佳。同时，对培养基中无机盐的添加进行了研究，确定最佳的无机盐为ZnSO4。通过对磷酸盐浓度的测试，确定了发酵培养基KH2PO4的添加浓度为0.5g/L时，多拉菌素的产量最高，可达12.98μg/ml。