论文部分内容阅读
缺氧诱导因子(HIF-1α)是组织细胞缺氧时的一个重要调节因子；脯氨酸羟化酶(PHDs)则通过羟化作用调节HIF-1α的转录活性。本文通过蛋白质重组技术获得脯氨酸羟化酶，应用HPLC和质谱技术研究脯氨酸羟化酶的活性并筛选出一系列多氮类小分子抑制剂，主要工作为：
根据埃希氏大肠杆菌密码子，优化并合成了脯氨酸羟化酶基因，目的基因pUC57-PHD3与pET32a(+)表达载体连接后转化至大肠杆菌中在25℃进行诱导表达，并运用亲和层析法进行纯化。脯氨酸羟化酶催化底物HIF-1α(556-574)上的pro564发生羟化作用并使其转化为羟脯氨酸，运用MALDI-TOF-MS检测羟化产物，发现底物的质谱峰有了16 Da的位移。研究脯氨酸羟化酶羟化作用的动力学机制及底物浓度和其他辅因子如Fe2+、抗坏血酸、2-酮戊二酸等对羟化作用的影响，结果表明脯氨酸羟化酶的米氏常数Km值为2.35×10-4 mol/L。底物及其他辅因子浓度较高时，它们都能抑制脯氨酸羟化酶对底物的羟化作用。且比较每一组实验结果，可以发现每一种因子对最大酶反应速率都有一个最佳的浓度范围。通过系列实验，得出最佳反应条件：[Fe2+](50μM)，[ascorbate](2mM)，[BSA](2mg/ml)，[catalase](0.6mg/ml)，[2-oxo](160μM)，[HIF](0.15-0.2mg/ml)，[PHD](10-20μg)，37℃反应2小时。
运用HPLC和质谱技术筛选出一系列多氮化合物小分子抑制剂，并初步探讨了这些小分子抑制剂的作用机理。四种多氮化合物(1-4)对脯氨酸羟化酶羟化作用的半抑制浓度(IC50值)分别为17.5，16.0，12.8，60.4μM。从双倒数曲线(1/V vs1/[HIF-1α(556-574)])上可以看出四种多氮化合物(1-4)都为非竞争抑制作用，且它们的抑制常数Ki值分别为62.0，25.2，67.8，55.0μM。本文所探讨的小分子抑制剂和底物HIF-1α在结构上没有相似之处，易和亚铁离子结合，这种结合并不影响底物和酶的结合。紫外光谱测定四种配体和Fe2+形成配合物的稳定常数分别为3.4×103cm-1.mol-1.L，4.0×103 cm-1.mol-1.L，4.2×103cm-1.mol-1.L和2.5×103cm.mol-1.L。结果表明：和亚铁离子形成配合物的稳定常数越大的化合物，其IC50值越小，对脯氨酸羟化酶的抑制作用也越好。同时探讨了这四种多氮化合物的金属配合物对脯氨酸羟化酶的作用，结果表明它们的金属配合物都不能抑制脯氨酸羟化酶的羟化作用。这几种脯氨酸羟化酶小分子抑制剂能否有效的调节缺氧诱导因子HIF-1α，及其对HIF-1α的信号转导的影响作用，包括对下游基因VEGF，EPO等的调控，则需要体内实验的进一步论证。