肾阳虚哮喘大鼠模型的建立与评价研究

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目的:1.对近20年现代文献及古典著作中关于肾阳虚证及病证结合模型的建立与评价方面进行了整理研究,为建立哮喘的病证结合模型奠定了理论基础。2.以大鼠为研究对象,通过以方测证的方法,结合四诊信息检测和实验室指标检测,系统地评价肾阳虚哮喘大鼠模型的成功与否,旨在建立哮喘大鼠肾阳虚病证结合模型,对中医证候动物模型研究具有重要意义。  方法:1.分组与造模:取雄性SD大鼠50只,体重140-160g,随机分为5组。分别为正常组、哮喘模型组、肾阳虚哮喘模型组、肾阳虚哮喘模型+金匮肾气汤组(以下简称金匮肾气汤组)、肾阳虚哮喘模型+六味地黄汤组(以下简称六味地黄汤组),每组10只。除正常组外分别于第1天和第8天对各组大鼠进行致敏。同时,于第1天起肾阳虚哮喘模型组、金匮肾气汤组、六味地黄汤组分别按照1.5ml/200g的剂量灌胃地塞米松混悬液,每天一次,连续14天。2周后各组大鼠以2%卵蛋白雾化吸入1分钟,诱发哮喘发作,隔天1次,引喘2周。正常组以生理盐水替代致敏及雾化。引喘开始后,金匮肾气汤组及六味地黄汤组分别以13ml/kg的剂量治疗,每天1次,共2周:2.模型评价:(1)基于四诊信息检测的评价:①一般辨证(宏观辨证,主要是望诊):在造模与用药的同时,观察动物的精神、毛发等一般状况,每隔3日测体重。②计量化辨证:造模结束后,采集各组大鼠的爪尾图像,测量大鼠的爪温和腋温,利用Photoshop图像分析软件提取爪尾图像的R(red)、G(green)、B(blue)色度值,求得代表红色程度的r值及阳虚程度。(2)实验室指标评价:通过病理学指标,分子生物学指标、ELISA指标来评价肾阳虚哮喘大鼠模型。(3)综合评价:通过四诊信息的一般辨证、计量化辨证结果,结合实验室各项指标的变化,综合评价肾阳虚哮喘大鼠模型的成功与否。  结果:1.一般指标检测结果:(1)体重:第1天各组大鼠体重无统计学差异(P>0.05)。第14天、第21天正常组体重明显高于肾阳虚哮喘模型组(P<0.05)。第28天,金匮肾气汤组的体重明显高于肾阳虚哮喘模型组和六味地黄汤组(P<0.01)。用药治疗后,金匮肾气汤组的体重增长速度快于肾阳虚哮喘模型组。(2)温度:正常组的爪温、腋温最高,金匮肾气汤组次之;肾阳虚哮喘模型组与六味地黄汤组的腋温、爪温最低,且两组间无统计学差异(P>0.05)。2.计量化辨证结果:(1)各组r值比较:肾阳虚哮喘模型组的爪尾r值均低于正常组(P<0.05);金匮肾气汤组的爪尾r值均高于肾阳虚哮喘模型组(P<0.05)(2)阳虚评判结果:肾阳虚哮喘模型组有9只大鼠阳虚。3.实验室指标检测结果:(1)病理结果:肾阳虚哮喘模型组出现气管收缩、炎性细胞浸润等表现,病变较正常组及哮喘模型组严重,金匮肾气汤组病变程度明显减轻,而六味地黄汤组改善不明显。肾阳虚哮喘模型组胸腺萎缩,重量下降,金匮肾气汤组胸腺重量明显大于肾阳虚哮喘模型组(P<0.05)(2) ELISA结果:肾阳虚哮喘模型组CGMP高于正常组,CAMP/CGMP小于正常组(P<0.05):正常组的肾上腺皮质酮含量最高,金匮肾气汤组次之;肾阳虚哮喘模型组与六味地黄汤组的肾上腺皮质酮含量最低,且两组间无统计学差异(P>0.05)。(3)TGF-β1含量测定结果:免疫荧光、PCR、Western-Blot结果均显示肾阳虚哮喘模型组的TGF-β1表达量高于正常组和金匮肾气汤组(P<0.05)。  结论:(1)本研究利用地塞米松灌胃复合卵蛋白雾化复制肾阳虚哮喘病证结合模型的方法,成功建立了肾阳虚哮喘大鼠模型。(2)通过以方测证的方法结合四诊信息检测结果及实验室指标检测结果综合评价,判断造模的成功率为90%,为中医证候动物模型的研究提供了新的思路和方法。(3)通过实验检测结果分析,肾阳虚哮喘模型组胸腺萎缩、爪腋温和爪尾r值最低、TGF-β1高表达,认为肾阳虚哮喘模型组的病变程度最重,为证候的生物基础研究提供了可靠模型,也为中医药复方药剂及中药药理研究提供了工具。同时,对阐释动物证候的本质及规范哮喘动物证候模型的研究方法,具有重要意义。
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