小桐子细胞分裂素氧化酶基因(JcCKXs)的克隆及功能分析

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小桐子(Jatropha curcas L.)属于大戟科多年生灌木或小乔木,是一种很有潜力的生物能源植物,但由于其种子产量低,严重制约了小桐子产业化生产。小桐子的雌花数少,雌雄花比例低是小桐子种子产量低的最主要原因之一。研究发现,对小桐子喷施外源细胞分裂素6-BA能有效地促进其花发育,增加总花数,提高雌雄花比例。  细胞分裂素氧化酶(cytokinin oxidase,CKX)是一类不可逆降解细胞分裂素的氧化酶,在很多植物中被证明参与内源细胞分裂素含量的调控,但有关小桐子CKX的研究工作尚未见文献报道。本研究旨在克隆JcCKXs基因全长cDNA序列并分析小桐子JcCKXs基因的表达模式,采用病毒诱导的基因沉默(VIGS)来研究小桐子JcCKXs基因功能,同时构建JcCKXs基因高表达载体转化拟南芥,探讨其生物学功能。通过调控JcCKXs基因的表达改变小桐子内源细胞分裂素(CK)的水平,为小桐子遗传性状的改良和优良品种的培育奠定基础。  本研究对小桐子基因组数据库中的JcCKXs序列和本实验室小桐子cDNA文库中的JcCKXs序列进行分析比对,设计特异引物,利用PCR和RACE(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆获得了小桐子JcCKXs家族的5个成员并分别命名为JcCKX1、JcCKX3、JcCKX4、JcCKX6和JcCKX7。JcCKX2和JcCKX5为小桐基因组数据库和本实验室cDNA文库中已有cDNA全长序列的基因。对JcCKXs的结构进行分析发现,JcCKX2、JcCKX3、JcCKX4和JcCKX5基因结构较保守,都含有5个外显子和4个内含子。通过氨基酸序列比对分析,发现JcCKX2和JcCKX4同源性高达78%,JcCKX1和JcCKX6同源性达71%,JcCKX4与JcCKX7同源性仅39%,其它成员间的同源性在40%~59%。  采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法,分别分析了JcCKX1-3、JcCKX5-7六个基因在小桐子根、茎、茎顶端、成熟叶、幼叶、花芽、果和种子中的表达情况。结果显示:JcCKX1在花芽和根中表达较高,在种子和茎中表达较少;JcCKX2基因主要在成熟叶、茎和茎顶端中表达,在果和根中表达较低;JcCKX3基因主要在种子、根和花芽中表达,在果和成熟叶中表达较低;JcCKX5主要在小桐子成熟叶、幼叶和种子中表达;JcCKX6在根、花芽和茎顶端中表达较高,在果和种子中表达较低;JcCKX7在成熟叶、种子、花芽和幼叶等多个组织部位中表达都较高。  采用qRT-PCR方法分析JcCKX1、JcCKX3和JcCKX5-7基因在小桐子花发育中的表达情况,发现JcCKX5在雄花中的表达量大于在雌花中的表达量,JcCKX6在雌花中的表达量大于在雄花中的表达量。伴随花的发育,雌、雄花开放,JcCKX5和JcCKX6在开放的雌、雄花中的表达量较在未开放的雌、雄花中的表达量相应减少。未开放的雄花中,JcCKX5表达量最高;未开放的雌花中,JcCKX6的表达量最高。  本研究构建了9个JcCKXs VIGS沉默载体,用含烟草脆裂病毒的JcCKXsVIGS沉默载体浸染小桐子,并未发现有明显的表型变化。同时,构建了JcCKX1和JcCKX5基因的高表达载体并转化拟南芥。通过卡那霉素抗性筛选出JcCKX1转基因拟南芥12株,JcCKX5转基因拟南芥16株。过量表达JcCKX1和JcCKX5转基因拟南芥的种子相对于野生型拟南芥种子变大,根变长。
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