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昆虫围食膜是中肠上皮细胞分泌的由几丁质和蛋白质构成的薄膜，具有两个重要的生理功能。第一，围食膜是天然的物理屏障，其隔离食物与上皮细胞，可抵御外源有害物质的入侵。干扰或破坏围食膜结构，将促进病原微生物或杀虫剂对昆虫的侵害，影响昆虫正常发育，导致死亡。因此，围食膜是害虫防治中重要的作用对象，参与围食膜形成和维持其结构稳定的关键蛋白被认为是潜在的生物防治靶标。第二，围食膜为中肠不同区室的功能分化提供结构基础，其将中肠分隔为上皮细胞、外围食膜空间(EcPS)和内围食膜空间，其中EcPS是位于上皮细胞与围食膜之间的空腔，是唯一未被研究的中肠区室，包含大量上皮细胞分泌蛋白，这些蛋白可能参与围食膜的形成和结构的动态变化。因此，对于EcPS蛋白的研究在以围食膜为作用对象的靶标发现中具有重要意义。
家蚕作为鳞翅目害虫治理的靶标基因研究模型，其中肠组织发达、基因组信息已知，因此被广泛应用于昆虫围食膜的研究。本论文以家蚕为研究材料，开展两部分研究工作:一是EcPS蛋白质组学研究，鉴定获得在维持围食膜结构/形态完整性方面发挥重要作用的蛋白;二是根据蛋白质组结果，选取了参与围食膜几丁质修饰的几丁质脱乙酰基酶(CDA，EC3.5.1.41)作为重点研究对象，进行催化机制和蛋白结构的研究，并与表皮几丁质修饰系统的CDA进行比对研究。本论文的研究结果可揭示昆虫CDA的结构-功能关系，并为害虫防治提供新的策略。
(一)EcPS蛋白质组的研究
以家蚕中肠EcPS为研究对象，选取了进食最为旺盛的五龄第五天和围食膜结构解离的游走期幼虫，采用串联质谱标签(TMT)标记的半定量蛋白质组学，结合基因分类和富集分析等生物信息学方法，解析和比较了两个时期家蚕幼虫EcPS蛋白的组成。主要获得以下结果:
(1)两个发育时期的EcPS蛋白质组共鉴定70个分泌蛋白，根据功能注释可分为消化酶、营养贮存蛋白、免疫防御蛋白、几丁质代谢相关蛋白和其他功能未知蛋白。其中，在几丁质代谢相关蛋白中发现了中肠CDA(BmCDA8)。
(2)对上述功能蛋白进行基因时空表达模式分析，发现消化酶主要在五龄第五天上调表达，且均在中肠后部高表达，而营养贮存蛋白和免疫防御蛋白则在游走期上调表达，在中肠前部高表达，研究结果表明中肠EcPS的蛋白组成会根据昆虫不同发育时期、不同空间的需求而发生动态变化。
(3)BmCDA8基因的转录水平在游走期上调，表明游走期幼虫需要积累BmCDA8蛋白，参与围食膜几丁质修饰，影响围食膜结构的解离过程。
(二)家蚕CDA的研究
为了探究BmCDA8的功能，本论文进行了基因表达模式分析、蛋白重组表达、生化性质及晶体结构的研究，并与家蚕基因组数据库中的其它两个中肠CDA(BmCDA6和BmCDA7)进行了比较研究，揭示了中肠CDA的催化机制和结构-功能关系。本论文进一步研究了家蚕表皮CDA(BmCDA1)的催化机制和结构-功能关系，并将其与中肠CDA进行比较。主要获得以下结果:
(1)基因表达分析及酶学活性
基因表达模式分析表明，BmCDA6特异性高表达于蜕皮期，该时期幼虫的围食膜较厚、富含的几丁质层较多。与BmCDA6不同，BmCDA7和BmCDA8在蜕皮期下调表达，而在进食期高表达，该时期围食膜较薄、几丁质层较少。值得注意的是，BmCDA8除了在进食期高表达，其在游走期具有更高的表达水平。三个CDA基因在不同发育时期的表达水平差异表明它们可能具有不同的功能分化。
通过基因克隆、重组表达和分离纯化获得了三个CDA蛋白，比较了它们对围食膜几丁质的结合能力和酶学活性。三个CDA对围食膜几丁质具有相似的结合能力，但酶活力存在较大的差异，其中BmCDA7的酶活力最高，BmCDA8的酶活力较弱，而BmCDA6对围食膜几丁质无活力。综上结果表明BmCDA6可能作为几丁质结合蛋白，参与围食膜几丁质的保护，BmCDA7和BmCDA8则参与家蚕不同发育阶段的围食膜几丁质的修饰和重塑。
(2)晶体结构
通过硒代培养及悬滴气相扩散法，获得了BmCDA8的晶体结构(PDB登录号5Z34)，分辨率为2.4(A)。与细菌和真菌来源的CDA结构对比分析发现，BmCDA8具有两个特有的结构元件:(β/α)7桶上的loop插入区和C端loop区，它们参与构成底物结合裂缝的两端，形成一种独特的长底物结合裂缝结构。以BmCDA8结构为模板，模拟了BmCDA6和BmCDA7的蛋白结构，比较三者结构的差异，发现loop区不同氨基酸的组成可能决定了三个CDA蛋白功能的差异。
(3)脱乙酰基作用模式及其结构基础
BmCDA8对GlcNAc和(GlcNAc)2无活性，而对(GlcNAc)3到(GlcNAc)6的活性随着糖链的长度增加而增高，说明BmCDA8存在至少三个糖基结合位点。质谱鉴定结果表明底物(GlcNAc)3和(GlcNAc)4没有完全被脱乙酰基，它们均保留了还原端的两个GlcNAc残基。结合酶活性结果，说明BmCDA8发挥活力需要底物占据0、+1和+2结合位点，其中0位参与催化反应，+1和+2位稳定非还原端两个GlcNAc残基。
结合分子动力学模拟以及氨基酸定点突变验证，确定了BmCDA8中0、+1和+2结合位点的结构。(GlcNAc)3被结合在底物结合裂缝的0到+2位，其中+1位糖环的乙酰基与Gln125形成氢键相互作用，+2位糖环的C3羟基和C5羟基分别与Ser241和Gln125侧链形成氢键。其中，Ser241对底物结合发挥关键作用，突变体S241A完全丧失了催化活性。
(4)表皮CDA(BmCDA1)的催化机制和晶体结构
体外酶活测定实验发现，只有BmCDA1存在时，我们没有检测到其酶活性，不过家蚕蜕皮液的加入可以显著提高BmCDA1的酶活性。通过进一步研究我们发现蜕皮液的组分——几丁质结合蛋白CPAP3-A1也可以显著提高BmCDA1的酶活性。此外，体外pull-down实验表明，CPAP3-A1可以捕获BmCDA1。这些结果表明BmCDA1需要与其他蛋白相互作用进而催化脱乙酰基过程。
研究获得了BmCDA1催化结构域(BmCDA1-CAD)的晶体结构(PDB登录号5ZNS)，分辨率为2.4(A)。与BmCDA8结构比较发现，虽然它们整体结构相似性高(RMSD为1.3(A))，但底物结合裂缝具有两个重要差异:一是BmCDA1的+2位点突变为丙氨酸，不能与底物产生相互作用;二是BmCDA1的底物结合裂缝与BmCDA8相比更为开放，并缺少疏水氨基酸残基。这两点可能影响了BmCDA1与底物的结合，导致其具有较低的脱乙酰基活性。
综上，本研究不仅为揭示家蚕中肠外围膜空间的功能提供蛋白信息，同时为开发以围食膜为靶标的绿色农药提供了蛋白结构基础。
家蚕作为鳞翅目害虫治理的靶标基因研究模型，其中肠组织发达、基因组信息已知，因此被广泛应用于昆虫围食膜的研究。本论文以家蚕为研究材料，开展两部分研究工作:一是EcPS蛋白质组学研究，鉴定获得在维持围食膜结构/形态完整性方面发挥重要作用的蛋白;二是根据蛋白质组结果，选取了参与围食膜几丁质修饰的几丁质脱乙酰基酶(CDA，EC3.5.1.41)作为重点研究对象，进行催化机制和蛋白结构的研究，并与表皮几丁质修饰系统的CDA进行比对研究。本论文的研究结果可揭示昆虫CDA的结构-功能关系，并为害虫防治提供新的策略。
(一)EcPS蛋白质组的研究
以家蚕中肠EcPS为研究对象，选取了进食最为旺盛的五龄第五天和围食膜结构解离的游走期幼虫，采用串联质谱标签(TMT)标记的半定量蛋白质组学，结合基因分类和富集分析等生物信息学方法，解析和比较了两个时期家蚕幼虫EcPS蛋白的组成。主要获得以下结果:
(1)两个发育时期的EcPS蛋白质组共鉴定70个分泌蛋白，根据功能注释可分为消化酶、营养贮存蛋白、免疫防御蛋白、几丁质代谢相关蛋白和其他功能未知蛋白。其中，在几丁质代谢相关蛋白中发现了中肠CDA(BmCDA8)。
(2)对上述功能蛋白进行基因时空表达模式分析，发现消化酶主要在五龄第五天上调表达，且均在中肠后部高表达，而营养贮存蛋白和免疫防御蛋白则在游走期上调表达，在中肠前部高表达，研究结果表明中肠EcPS的蛋白组成会根据昆虫不同发育时期、不同空间的需求而发生动态变化。
(3)BmCDA8基因的转录水平在游走期上调，表明游走期幼虫需要积累BmCDA8蛋白，参与围食膜几丁质修饰，影响围食膜结构的解离过程。
(二)家蚕CDA的研究
为了探究BmCDA8的功能，本论文进行了基因表达模式分析、蛋白重组表达、生化性质及晶体结构的研究，并与家蚕基因组数据库中的其它两个中肠CDA(BmCDA6和BmCDA7)进行了比较研究，揭示了中肠CDA的催化机制和结构-功能关系。本论文进一步研究了家蚕表皮CDA(BmCDA1)的催化机制和结构-功能关系，并将其与中肠CDA进行比较。主要获得以下结果:
(1)基因表达分析及酶学活性
基因表达模式分析表明，BmCDA6特异性高表达于蜕皮期，该时期幼虫的围食膜较厚、富含的几丁质层较多。与BmCDA6不同，BmCDA7和BmCDA8在蜕皮期下调表达，而在进食期高表达，该时期围食膜较薄、几丁质层较少。值得注意的是，BmCDA8除了在进食期高表达，其在游走期具有更高的表达水平。三个CDA基因在不同发育时期的表达水平差异表明它们可能具有不同的功能分化。
通过基因克隆、重组表达和分离纯化获得了三个CDA蛋白，比较了它们对围食膜几丁质的结合能力和酶学活性。三个CDA对围食膜几丁质具有相似的结合能力，但酶活力存在较大的差异，其中BmCDA7的酶活力最高，BmCDA8的酶活力较弱，而BmCDA6对围食膜几丁质无活力。综上结果表明BmCDA6可能作为几丁质结合蛋白，参与围食膜几丁质的保护，BmCDA7和BmCDA8则参与家蚕不同发育阶段的围食膜几丁质的修饰和重塑。
(2)晶体结构
通过硒代培养及悬滴气相扩散法，获得了BmCDA8的晶体结构(PDB登录号5Z34)，分辨率为2.4(A)。与细菌和真菌来源的CDA结构对比分析发现，BmCDA8具有两个特有的结构元件:(β/α)7桶上的loop插入区和C端loop区，它们参与构成底物结合裂缝的两端，形成一种独特的长底物结合裂缝结构。以BmCDA8结构为模板，模拟了BmCDA6和BmCDA7的蛋白结构，比较三者结构的差异，发现loop区不同氨基酸的组成可能决定了三个CDA蛋白功能的差异。
(3)脱乙酰基作用模式及其结构基础
BmCDA8对GlcNAc和(GlcNAc)2无活性，而对(GlcNAc)3到(GlcNAc)6的活性随着糖链的长度增加而增高，说明BmCDA8存在至少三个糖基结合位点。质谱鉴定结果表明底物(GlcNAc)3和(GlcNAc)4没有完全被脱乙酰基，它们均保留了还原端的两个GlcNAc残基。结合酶活性结果，说明BmCDA8发挥活力需要底物占据0、+1和+2结合位点，其中0位参与催化反应，+1和+2位稳定非还原端两个GlcNAc残基。
结合分子动力学模拟以及氨基酸定点突变验证，确定了BmCDA8中0、+1和+2结合位点的结构。(GlcNAc)3被结合在底物结合裂缝的0到+2位，其中+1位糖环的乙酰基与Gln125形成氢键相互作用，+2位糖环的C3羟基和C5羟基分别与Ser241和Gln125侧链形成氢键。其中，Ser241对底物结合发挥关键作用，突变体S241A完全丧失了催化活性。
(4)表皮CDA(BmCDA1)的催化机制和晶体结构
体外酶活测定实验发现，只有BmCDA1存在时，我们没有检测到其酶活性，不过家蚕蜕皮液的加入可以显著提高BmCDA1的酶活性。通过进一步研究我们发现蜕皮液的组分——几丁质结合蛋白CPAP3-A1也可以显著提高BmCDA1的酶活性。此外，体外pull-down实验表明，CPAP3-A1可以捕获BmCDA1。这些结果表明BmCDA1需要与其他蛋白相互作用进而催化脱乙酰基过程。
研究获得了BmCDA1催化结构域(BmCDA1-CAD)的晶体结构(PDB登录号5ZNS)，分辨率为2.4(A)。与BmCDA8结构比较发现，虽然它们整体结构相似性高(RMSD为1.3(A))，但底物结合裂缝具有两个重要差异:一是BmCDA1的+2位点突变为丙氨酸，不能与底物产生相互作用;二是BmCDA1的底物结合裂缝与BmCDA8相比更为开放，并缺少疏水氨基酸残基。这两点可能影响了BmCDA1与底物的结合，导致其具有较低的脱乙酰基活性。
综上，本研究不仅为揭示家蚕中肠外围膜空间的功能提供蛋白信息，同时为开发以围食膜为靶标的绿色农药提供了蛋白结构基础。