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在细胞核仁中,核糖体的生物合成是高度协调,多步骤的一个过程。核糖体RNA经过合成,加工和修饰等一系列的步骤,被装配成核糖体的亚基。核糖体RNA的合成是核糖体生物合成的第一个重要步骤,是一个高度有效的调控过程。核糖体RNA的合成受到细胞外很多因素的影响,比如营养的供给,生长因子的刺激等,因此,核糖体RNA基因的转录在细胞生长和增殖的过程中发挥着举足轻重的作用。 哺乳动物的核糖体RNA基因是由RNA聚合酶Ⅰ(Po1Ⅰ)负责转录的。根据表观遗传修饰的不同,核糖体RNA基因大致可被分为两类:转录活跃的rRNA基因和转录沉默的rRNA基因。转录活跃的rDNA启动子是非甲基化的,具有显著的常染色质组蛋白修饰,而沉默的-rDNA启动子则是甲基化的,并且表现出异染色质的特征。早前的研究发现,转录因子TTF-Ⅰ能够招募DNA依赖的ATP酶CSB到rRNA基因上,并能促进rRNA的合成。另外,TTF-Ⅰ也能招募染色质改构复合体NoRC(包括ATP酶SNF2h和TIP5)到rDNA的启动子上,而使一部分rDNA异染色质化,从而抑制它们的转录。本研究中,我们发现了另外一种基于染色质的激活Po1Ⅰ转录的表观遗传学机制。我们发现NuRD复合体的ATP酶亚基CHD4与Po1Ⅰ转录因子UBF共定位于核仁。此外,CSB和TTF-Ⅰ均能与CHD4相互作用,并将其招募到rDNA启动子上,CSB与CHD4协作能够明显地促进rDNA转录。另一方面,我们也发现shRNA介导敲减掉CHD4会显著抑制45S前体rRNA的合成,同时还导致Po1Ⅰ转录复合体的组装受到抑制以及rDNA启动子的甲基化水平上升。这一系列的结果表明,CHD4/NuRD是Po1Ⅰ有效转录rDNA所必须的。 转录活跃和转录沉默的rDNA启动子的不同之处还体现在核小体位置的不同。在活跃转录的rDNA上,启动子区域的核小体覆盖了-157位到-2的核苷酸(NucU),而转录沉默的rRNA基因,其核小体的覆盖范围向下游延伸了24个核苷酸(NucD)。此前的研究表明NoRC复合体能将rDNA启动子区域的核小体移动到下游的位置(NucD),从而阻止转录起始复合体的组装以抑制基因转录。在本研究中,我们也分析了CHD4结合的核小体在rDNA启动子上的位置。我们发现CHD4结合位于rDNA启动子下游的核小体,亦即NucD位置的核小体。然而我们进一步的分析发现CHD4结合的NucD是非甲基化的,而NoRC结合的NucD是高度甲基化的,这表明CHD4结合的NucD与NoRC构建或者结合的NucD是不同的,是有着本质区别的。事实上确实如此,CHD4结合的NucD是一组特有的核小体,这类核小体带有二价的组蛋白修饰(H3K4me3,H3K27me3和去乙酰化的组蛋白H4)。另一方面,CHD4仅与转录前复合体的组分(包括UBF和SL1/TIF-IB),共定位于rDNA启动子,而不是Po1Ⅰ和TIF-IA。这些结果均表明CHD4/NuRD结合的rR-NA基因是一类允许激活转录的基因,也就是驻留状态的基因。 此外,CHD4蛋白有两个PHD结构域,两个chromo结构域(CD)以及一个ATP酶结构域。对这些结构域进行点突变,均导致CHD4丧失促进rDNA转录的能力,这表明这些结构域是CHD4在rDNA转录的过程中发挥作用所必需的。特别需要指出的是,除了CSB和TTF-Ⅰ,CHD4的CD2结构域和组蛋白修饰H3K4me3也参与了CHD4结合rDNA的过程。敲减CSB和CHD4后,分析rDNA启动子的核小体位置变化,我们发现CSB负责将NucD的核小体移动到NucU的位置,而CHD4的作用却恰恰相反,负责将.NucU移动到NucD。这些结果说明CHD4/NuRD依赖的rDNA转录激活需要CHD4和CSB同时参与染色质改构:CHD4将rDNA启动子核小体移动到NucD,而CSB则将rDNA启动子核小体重新移回到Nucu,以便于Po1Ⅰ转录起始复合体的组装。 先前的报道发现,细胞分化的过程伴随着rDNA启动子核小体的移动,绝大多数位于NucU的核小体被移动到了NucD的位置。为了检测细胞分化过程中是否有驻留状态的rRNA基因累积,我们比较了未分化和分化的C2C12细胞的rDNA转录,组蛋白修饰,DNA甲基化以及rDNA启动子的核小体位置。我们发现在分化的C2C12细胞中,rDNA转录明显下降。伴随C2C12细胞的分化,CHD4,H3K4me3和H3K27me3在rDNA启动子的结合明显增加,而该区域的DNA甲基化却并不变化。另一方面,细胞分化也造成了NucD在rDNA启动子的大量累积,这表明,很大一部分分化前活跃转录的rRNA基因被CHD4/NuRD转化成了驻留状态的基因,以便在适当的时候被激活转录。 综上,本研究发现CHD4/NuRD在rRNA基因启动子区域参与构建并维持一种特有的染色质结构,这种结构的rRNA基因虽然不转录,但却处于一种等待激活转录的驻留状态。驻留状态的rDNA启动子是非甲基化的,结合有转录前复合体的组分。驻留状态rDNA启动子的核小体位于NucD的位置,不利于转录复合体的组装。在分化细胞中,伴随着rDNA转录下调,更多的CHD4/NuRD结合到了rDNA到启动子上,构建并维持了大量驻留状态的rRNA基因。重新激活这些驻留状态的rRNA基因需要CSB蛋白的参与,它能将NucD位置的核小体重新移回到NucU,从而有利于。Po1Ⅰ转录复合体的组装以及转录的起始。本研究发现了一个特有的调控基因转录的表观遗传机制,在该机制中,相互协作的染色质改构蛋白利用其相反的酶活性,通过构建不同状态的染色质结构实现对基因转录的激活。