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目的:
研究藤龙补中汤对大肠癌生长、转移的作用及可能机制。
方法:
本研究分为三部分进行。
第一部分为建立大肠癌皮下移植瘤模型,以藤龙补中汤灌胃治疗,观察肿瘤生长情况;治疗结束后取材肿瘤组织,称量肿瘤质量。采用TUNEL法检测细胞凋亡,计算凋亡率,酶底物/比色法检测caspase-3/8/9酶活性,采用细胞衰老β-半乳糖苷酶染色法检测细胞衰老。免疫组织化学染色法检测PARP剪辑,肿瘤血管生成, XIAP、Survivin、p16、p21、VEGF-A表达,以及RB磷酸化。
第二部分通过尾静脉注射建立小鼠CT26大肠癌肺转移模型,以藤龙补中汤灌胃3周后,剥离小鼠肺组织,称重并计数转移结节;免疫组织化学方法检测肺转移灶肿瘤相关巨噬细胞分布,血管生成以及VEGF-A表达。
第三部分,在第二部分基础上采用IL-4诱导M2型肿瘤相关巨噬细胞分化,同时以不同浓度的藤龙补中汤作用。Western blot法检测M2型巨噬细胞标志基因Arg-1表达,ELISA、RT-PCR法检测M2型巨噬细胞IL-10、VEGF表达。Westernblot法检测IL-4相关信号转导蛋白STAT6,JAK3表达及磷酸化。采用共培养法培养M2型巨噬细胞与CT26大肠癌,检测M2型巨噬细胞对CT26细胞粘附、移动及侵袭的影响。进一步采用ELISA、RT-PCR法检测M2巨噬细胞转移相关基因EGF表达,western blot检测M2型巨噬细胞对CT26细胞转移相关基因MMP-9表达。
结果:
1.藤龙补中汤对大肠癌生长的作用:藤龙补中汤可抑制CT26大肠癌生长,增强CT26结肠癌caspase-3/8/9活性,促进PARP剪辑,抑制凋亡相关基因Survivin和XIAP表达,促进CT26结肠癌细胞凋亡;上调衰老相关基因p16和p21表达,抑制RB磷酸化,促使CT26结肠癌细胞衰老;藤龙补中汤同时可以抑制血管内皮生长因子VEGF-A表达及血管生成(P<0.01)。藤龙补中汤可以增强5-Fu在抑制肿瘤生长、活化caspases、抑制XIAP与Survivin表达以及细胞凋亡方面的作用(P<0.05)。
2.藤龙补中汤对大肠癌肺转移的影响:藤龙补中汤可以显著抑制结肠癌肺转移灶的发生和生长,藤龙补中汤治疗后小鼠肺转移结节和肺质量显著降低(P<0.01)。藤龙补中汤可以减少M2型巨噬细胞在CT26肺转移的分布,同时抑制VEGF-A表达以及血管生成(P<0.01)。
3.藤龙补中汤对M2型巨噬细胞分化的影响:藤龙补中汤可以显著抑制IL-4诱导巨噬细胞分化,抑制IL-4诱导Arg-(I)表达,抑制IL-4诱导IL-10、VEGF表达及分泌。藤龙补中汤可以抑制IL-4诱导STAT6和JAK3磷酸化。细胞共培养研究显示,藤龙补中汤可以抑制IL-4诱导巨噬细胞对CT26细胞粘附、移动及侵袭的作用,以及MMP-9在CT26细胞中的表达。藤龙补中汤可以抑制IL-4诱导EGF的表达及分泌。
结论:
藤龙补中汤可以抑制CT26大肠癌生长,其作用可能与促细胞凋亡、细胞衰老以及抑制血管生成相关,藤龙补中汤可以增强5-Fu对结肠癌的治疗作用。藤龙补中汤可以抑制CT26结肠癌肺转移,其作用可能与抑制M2型巨噬细胞、VEGF-A表达以及血管生成相关。藤龙补中汤可以抑制IL-4诱导M2型巨噬细胞分化,其作用可能与抑制STAT6和JAK3磷酸化相关。藤龙补中汤可以抑制M2型巨噬细胞介导CT26结肠癌细胞粘附、移动及侵袭,其作用可能与抑制CT26细胞MMP-9表达及M2型巨噬细胞分泌EGF相关。