人NDRG2（N-mycdown-streamregulatedgene2）基因为本研究小组首先发现并报道，该基因可能与细胞增殖和分化相关，但其具体的生物学功能有待进一步研究。我们课题组前期研究的结果对本课题的深入研究有重要的提示作用：RNA点杂交实验表明NDRG2在人的唾液腺组织中表达量极高；免疫组化结果显示NDRG2在小鼠的舌下腺导管上皮细胞特异性高表达；酵母双杂交实验寻找能与NDRG2相互作用的分子，最终筛选到12个有正确读框的的克隆，其中有3个克隆是Na+/K+-ATPaseβ1的肽段；生物信息学预测，在NDRG2上游调控区存在潜在的雌激素受体（ER）结合位点。　　唾液腺导管细胞的重要生物学功能是重吸收唾液中的Na+和Cl-等电解质，从而参与调节唾液（正常唾液渗透压为血浆渗透压的1/9）的生成，而唾液进入导管后Na+的重吸收依赖导管细胞腔侧分布的上皮细胞钠通道（epithelialsodiumchannel,ENaC）。有文献报道非洲蟾蜍卵母细胞中，NDRG2可以激活ENaC。Na+/K+-ATPaseβ1是Na+/K+-ATPase（又称为钠钾泵）的亚基，是Na+/K+-ATPase发挥泵功能不可缺少的组成成分。存在于唾液腺导管细胞基底侧的Na+/K+-ATPase，以主动耗能的方式将细胞中的Na+泵到细胞外，形成一定的细胞内外Na+浓度阶差，进而影响唾液腺导管细胞腔侧ENaC对从腺泡分泌进入导管的原始唾液中Na+的重吸收。临床口腔干燥症的好发人群为绝经后女性，50％以上的绝经后女性有自觉口干症状，口干病人的唾液电解质成分与正常人差异很大，唾液渗透压和电解质浓度往往明显增高、唾液粘稠。　　先前的研究结果强烈提示NDRG2在唾液腺组织中发挥重要的功能，特别是与唾液的生成可能高度相关，本课题将对此进行探讨和验证。　　【目的】：　　1、明确NDRG2在唾液腺组织中的分布和定位；2、研究NDRG2在唾液腺细胞中的功能与Na+/K+-ATPaseβ1的关联性；3、探讨NDRG2在人唾液腺细胞中是否受到雌激素的调控；4、整体水平分析雌激素与唾液形成之间的关系以及NDRG2在其中可能发挥的功能。　　【方法】：　　1、通过免疫组织化学和间接免疫荧光的方法明确NDRG2在唾液腺组织的分布与定位，RT-PCR分析正常人颌下腺NDRG1、NDRG2、NDRG3和NDRG4的表达情况。2、建立单层唾液腺导管细胞离子转运模型，检测NDRG2对各种离子和水分子转运的影响；运用哺乳动物双杂交和免疫共沉淀实验验证NDRG2与Na+/K+-ATPaseβ1的相互作用；间接免疫荧光观察NDRG2与Na+/K+-ATPaseβ1在细胞内是否存在共定位；分析NDRG2对Na+/K+-ATPase酶活性的影响；RealtimePCR和WesternBlot检测NDRG2对Na+/K+-ATPaseβ1表达的影响。3、RealtimePCR和WesternBlot分析17-β-雌二醇（E2）对NDRG2表达水平的影响；运用双报告基因、ChIP和EMSA等基因转录调控实验明确NDRG2是否受E2-ER转录复合物的调控。4、建立去势雌性大鼠模型（去卵巢手术）模拟绝经后女性体内雌激素水平，检测大鼠唾液流量、唾液电解质成分及颌下腺NDRG2、Na+/K+-ATPase和ENaC表达水平的变化。　　【结果】：　　1、NDRG2蛋白在唾液腺导管细胞胞浆中特异性高表达　　NDRG2蛋白主要表达于人三对大唾液腺（腮腺、颌下腺和舌下腺）以及大鼠的颌下腺的导管细胞胞浆，而腺泡细胞中表达很弱。RT-PCR结果表明正常人颌下腺组织NDRG2mRNA表达相对高，NDRG1和NDRG3的表达相对较低，而NDRG4几乎不表达、　　2、NDRG2可以结合并稳定Na+/K+-ATPaseβ1蛋白　　在单层唾液腺导管细胞离子转运模型中，感染NDRG2腺病毒或转染针对NDRG2的干涉片段，特异性过表达或沉默NDRG2，结果唾液腺导管细胞基底侧与腔侧Na+和Cl-浓度比值明显与NDRG2表达量成正比，而细胞基底侧与腔侧K+和Ca2+浓度比值没有明显的变化，基底侧和腔侧的液体体积均未出现显著改变。哺乳动物双杂交和免疫共沉淀结果进一步证实NDRG2和Na+/K+-ATPaseβ1可以相互作用。间接免疫荧光结果显示NDRG2和Na+/K+-ATPaseβ1在人永生化唾液腺导管细胞HSG的核周胞浆存在部分共定位。HSG细胞中相同总蛋白中Na+/K+-ATPase的活性与NDRG2的表达水平成正比，并且NDRG2可以稳定Na+/K+-ATPaseβ1蛋白，延长Na+/K+-ATPaseβ1蛋白的半衰期。　　3、NDRG2受E2-ERβ转录复合物的调控，是雌激素的靶基因　　E2可以时间和剂量依赖的方式上调NDRG2的表达，并且NDRG2mRNA和蛋白水平的表达均有所增加。间接免疫荧光实验表明：ERα和ERβ均主要分布于人唾液腺组织的导管细胞中，ERβ表达强度明显高于ERα，ERβ和NDRG2均高表达于唾液腺导管细胞。ERβ可以剂量依赖的方式增加NDRG2上游调控区报告基因的活性，而ERα不能激活报告基因，ERβ的特异性激动剂DPN能够增强报告基因活性，而ERα的特异性激动剂PPT不能激活报告基因，运用ERβ配体结合区截短突变体或干涉ERβ的表达均能显著降低报告基因的活性，并且将潜在的ERE（estrogenresponseelements）进行点突变，报告基因的活性明显降低。ChIP和EMSA实验检测到外源性ERβ或内源性ERβ均能结合于NDRG2上游调控区预测的ERE。　　4、NDRG2参与去势雌性大鼠口腔干燥　　去卵巢大鼠手术后体内雌激素水平明显迅速下降，去势雌性大鼠逐渐出现毛发枯疏、骨质疏松等与体内雌激素水平相关的表征；有明显的口腔干燥症状，即唾液流量减少、饮水增多及唾液中Na+和Cl-浓度增高。PCR结果显示去卵巢大鼠颌下腺组织中NDRG2和ENaCβ的mRNA水平明显减少，Na+/K+-ATPaseβ1mRNA水平无明显变化；免疫组化结果表明NDRG2、Na+/K+-ATPaseβ1和ENaCβ的蛋白含量均明显降低。　　【结论】：　　本课题揭示了NDRG2是受雌激素调控的下游靶基因之一，初步证实E2-ER转录复合物-NDRG2-Na+/K+-ATPaseβ1通路的存在，并且这个通路可能参与临床绝经后女性口腔干燥症。