磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide-3 kinase，P13K)-蛋白激酶B(protein kinase B，PKB，又称Akt)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantarget of rapamycin，mTOR)信号通路控制着众多在肿瘤发生发展中至关重要的细胞生物学过程，包括细胞增殖、凋亡、转录、翻译、代谢、新生血管生成以及细胞周期的调控，其中mTOR被认为是细胞生长和代谢的中心调控者。因此抑制mTOR信号通路成为肿瘤靶向治疗的热点。雷帕霉素(Rapamycin)是最早发现的mTOR抑制剂，具有显著的体内外抗肿瘤活性，但由于其水溶性和稳定性差限制了其作为肿瘤药物迸一步开发。目前已有三个雷帕霉素衍生物先后在国内外进行临床研究，包括Rad001(Novartis)、CCI-779(Wyeth)和AP23573(Ariad Pharmaceutics)。其中CCI-779和Rad001分别于2007年5月和2009年4月被美国食品药品监督局(Food and Drug Administration，FDA)批准上市用来治疗晚期肾癌。　　 通过筛选国家新药筛选中心南发俊课题组提供的一系列雷帕霉素衍生物，我们得到了Y31候选化合物。该化合物是基于近年来雷帕霉素的结构改造策略，设计简洁的合成路线得到的42位羟基烷基碳酸酯取代的水溶性衍生物。本课题旨在研究Y31的体内外抗肿瘤作用，同时深入探讨其作用靶点和抗肿瘤作用机　　 我们采用MTT(四甲基偶氮唑蓝)和SRB法(磺酰罗丹明)检测了Y31在20株不同组织来源的人肿瘤细胞株的细胞增殖抑制作用。结果显示Y31对多种组织来源的人肿瘤细胞株具有明显的增殖抑制作用，抑制效果和雷帕霉素相似，且具有和雷帕霉素相近的选择性。由于Y31较之雷帕霉素具有更好的理化性质，我们评价了Y31对于多种组织来源的肿瘤细胞裸小鼠移植瘤的生长抑制作用。结果显示，Y31口服有效，对人横纹肌肉瘤Rh30，人前列腺癌PC-3、人卵巢癌SKOV-3以及人肝癌BEL-7402移植瘤显示出比雷帕霉素和CCI-779更强的生长抑制活性，T/C值都小于40％。而Y31、雷帕霉素和CCI-779对于人胃癌MKN-45和SGC-7901移植瘤基本无效。　　 研究表明雷帕霉素类化合物进入细胞后首先和细胞中FK506结合蛋白12(FKBP-12)结合，再与mTOR结合进而抑制mTOR活性。我们利用表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)技术检测Y31和FKBP-12的结合，证明Y31能直接和FKBP-12结合，其结合常数KD为0.10×10-9M。雷帕霉素和FKBP-12的结合常数为1.96×10-9M，因此Y31和FKBP-12结合的亲和力较雷帕霉素更高。我们进一步检查Y31对肿瘤细胞mTOR及其信号通路的影响。研究表明Y31广泛地抑制人卵巢癌细胞SKOV-3、人胃癌SGC-7901、人肝癌BEL-7402、人横纹肌肉瘤Rh30以及人前列腺癌PC-3细胞中其下游底物蛋白起始因子4E结合蛋白1(eIF4E binding protein，4E-BP1)和p70核糖体S6激酶(p70S6K)的磷酸化水平，表明Y31能够抑制这些肿瘤细胞中mTOR的活性。受mTOR翻译调控的主要有cyclin D1和c-myc等在调控细胞周期方面发挥重要作用的蛋白，因此我们检测了Y31对肿瘤细胞周期分布的影响。Y31能够使Rh30细胞阻滞于G1期，并且能够部分阻碍nocodazole引起的G2/M期阻滞。Y31对肿瘤细胞移植瘤的生长抑制作用也是由于其对mTOR抑制所致。荷瘤裸小鼠口服给予Y313周后，瘤组织中4E-BP1和p70S6K磷酸化水平降低，并且其降低的程度和体内药效呈正相关。另外，Y31不仅导致肿瘤组织体积减小，而且使瘤组织中增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA)阳性细胞与对照组相比减少，表明处于增殖活跃的细胞减少。　　 肿瘤血管在实体瘤的发生发展中具有重要的作用，为肿瘤细胞提供氧气，养料并输送废物，同时提供转移的主要路线。肿瘤细胞主要通过分泌血管表皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)等刺激内皮细胞活化来促进血管新生。而且Akt-mTOR信号通路在内皮细胞的增殖和管腔形成过程中发挥了重要的作用。研究发现Y31不仅能够显著抑制内皮细胞的增殖，而且能抑制内皮细胞的管腔形成过程。半体内实验表明Y31明显抑制大鼠动脉环的微血管形成。另外，在Y31处理过的Rh30裸小鼠移植瘤组织中，微血管标志物内皮细胞血小板内皮细胞粘附分子-1(Platelet Endothelial Cell AdhesionMolecule-1，PECAM-1，也叫CD31)的表达明显减少。这些结果表明Y31不仅能抑制肿瘤增殖，而且同时抑制肿瘤血管新生。我们同时发现Y31能够抑制在缺氧条件下培养的Rh30细胞中缺氧诱导蛋白-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)的表达和VEGF的分泌。这可能是Y31抑制肿瘤血管新生的机制之一。　　 我们对Y31进行了初步的代谢和安全性研究。Rh30移植瘤裸小鼠口服有效剂量的Y31后检测全血、肝脏和组织中的Y31分布情况。结果显示，Y31在体内迅速转化成为代谢物雷帕霉素，给药后5 h检测不到原形药物。与直接口服同剂量的雷帕霉素相比，Y31口服生物利用度要优于雷帕霉素，且具有肿瘤分布特异性，在肿瘤组织中半衰期延长。SD大鼠连续口服给予10倍有效剂量的Y31二周后，未见动物死亡和明显的异常临床症状。　　 综上所述，本研究发现了一个结构新颖，合成工艺简单的雷帕霉素衍生物Y31，其在水中的溶解度较之雷帕霉素有极大的提高，具有显著的体内外抗肿瘤活性。尤其是Y31体内口服有效，口服生物利用度优于雷帕霉素，且富集于肿瘤组织。因此，我们认为Y31作为新的抗肿瘤药物候选化合物，具有优于现有化合物的综合性质。目前Y31已经进入系统的临床前研究阶段。　　 本实验室的前期工作证实，S9通过同时靶向P13K和mTOR能够浓度依赖性的抑制生长因子诱导的P13K-Akt-mTOR信号通路的激活。但细胞周期的结果提示S9作用细胞后引起M期阻滞，这一现象与以往常见的P13K-Akt-mTOR信号通路抑制剂不同，本研究的目的就是找出S9引起细胞M期阻滞的具体机制。　　 在引起细胞M期阻滞的大多数化合物都是微管紊乱剂，于是我们首先利用免疫荧光检测了S9对于微管蛋白的影响。结果显示，S9能够直接紊乱细胞内的微管结构，使其散在分布，而且这一现象与S9抑制P13K-Akt-mTOR信号通路无关。接着，我们在分子体系验证S9是否对微管有直接的靶向作用。我们利用微管蛋白在特定条件下能够在体外组装成丝状微管的特性，检测S9对微管蛋白聚合的影响。结果提示微管聚合被S9显著抑制。圆二色谱的实验也证实微管蛋白二级结构中α螺旋和β折叠的含量在S9作用后显著变化。SPR的实验更进一步验证了S9和微管蛋白的直接作用，并且和秋水仙素(Colchicine，COL)相比，有更好的亲和力。进一步，我们证明了S9和微管蛋白的结合位点。竞争实验的结果说明S9能够和COL竞争结合微管蛋白上的COL位点，而对长春花碱(Vinblastine，vLB)结合微管蛋白的VLB位点毫无影响。同时，我们通过分子对接模拟S9与微管蛋白的结合模式，S9虽然在分子结构上与秋水仙素迥异，但是依然能够以相似的空间排布占据COL的结合位点，而且二者与微管蛋白形成的氢键也大多类似。　　 综上所述，本研究详细阐明了PI3K/mTOR双重抑制剂s9通过同时直接靶向微管蛋白而引起细胞周期M期阻滞。在国际上第一次报道了兼具P13K/mTOR激酶抑制剂和微管紊乱剂双重特点的小分子先导化合物，对于以后肿瘤药物的研发具有重要的指导意义。该部分工作已在国际著名期刊杂志PLosOne上发表。