论文部分内容阅读
目的： 检测miR-30c在胃癌组织和胃癌细胞中的表达水平，进行体外功能试验，确定下游靶标，探讨miR-30c异常表达与胃癌发生的相关性并揭示相关分子机制。 方法： （1）阅读文献结合前期实验室获得的miRNA芯片表达数据，预测miR-30c调节的靶基因。 （2）采用Real-time PCR技术验证82对胃癌组织与癌旁远端组织样本中miR-30c、myc和PPARδ表达差异。 （3）体外培养分化不同的2株胃癌细胞，以获得永生化而无致癌性的人胃黏膜上皮细胞为对照。对体外培养的生长增殖期细胞进行转染，采用miR-30c-mimic、miR-30c-inhibitor和Negtive Control（NC）调控胃癌细胞中miR-30c的表达，瞬时转染后进行MTT法检测细胞增殖能力，利用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况，qRT-PCR、WesternBlot检测miR-30c靶蛋白BCL-9及下游基因Myc和PPARδ的表达情况。 （4）常规进行组织标本包埋、切片、系列脱蜡后采用免疫组化技术研究胃癌组织中BCL-9和GJA1的表达情况，并分析预测靶基因BCL-9和GJA1的差异表达与患者临床资料的相关性。 结果： （1）从前期胃癌miRNAs表达谱微阵列芯片筛选出一系列表达升高或降低的miRNAs，其中下调最显著为miR-30c，下调8.36倍（P<0.05）。采用Real-time PCR技术扩大样本进行验证，我们发现在82对胃癌组织与癌旁远端组织配对样本中，miR-30c在胃癌组织中呈低表达（P<0.05）,其表达趋势与芯片结果一致。且miR-30c表达下调水平与患者年龄相关（P<0.05）。 （2）转染miR-30c-mimic后细胞的增殖能力显著降低，MKN-45在转染后72h抑制率最高为18％，但与NC组比较在24h、48h、72h组间没有差异（P>0.05）。MKN-74转染后72h抑制率最高为17%，且较NC组24h与48和72小时有差异（P<0.05）。GES-1则在转染后48h达到最高抑制率26%，在48h与24和72小时与NC组相比较抑制率存在差异（P<0.05）。但是,转染miR-30c-inhibitor后，细胞的增殖能力则增强，MKN-45在转染24h后细胞增殖提高18%，与NC组比较24h与48和72小时组间比较存在差异（P<0.05）。MKN-74在转染后48h达到30%，在24h、48h、72h时与NC组比较组间存在差异（P<0.05）。GES-1则在转染后72h时细胞增殖能力增强12%，且24h、48h、72h时与NC组比较组间存在差异（P<0.05）。 （3）miRNA-30c-mimic转染三株细胞48h后，MKN-74细胞凋亡率则较NC组降低（P<0.05），而在GES-1细胞系中miRNA-30c-mimic组较NC组凋亡率升高（P<0.05）。转染miRNA-30c-inhibitor48h后，MKN-45凋亡比率较NC组升高（P<0.05），MKN-74细胞凋亡率则较NC组降低（P<0.05），进一步比较可以发现，在MKN74和GES-1细胞系中转染miRNA-30c-mimic较miRNA-30c-inhibitor组细胞凋亡率明显升高（P<0.05），即miRNA-30c-mimic促进凋亡，miRNA-30c-inhibitor则可以抑制凋亡，而在MKN45中则反之， （4）在MKN45细胞系中，转染miR-30c-mimic后较NC组G0/G1期细胞数量增加（ P<0.05），而在MKN74和GES1细胞系中，转染miR-30c-inhibitor后较NC组G0/G1期细胞数量增加（P<0.05）。 （5）Real-time PCR检测显示胃癌及癌旁组织中PPARδ和Myc在癌组织中表达降低，但与癌旁组织比较差异无显著性（P>0.05）。进行细胞转染后，我们发现，除GES-1细胞外，myc基因和PPARδ基因的表达同之前胃癌组织与癌旁组织的表达一致，即miR-30c高表达则下游myc基因和PPARδ基因也呈现高表达，反之则低表达。 （6）Western Blot检测显示，在MKN-74细胞系中转染miR-30c-mimic后较NC组（阴性对照组）BCL-9表达升高，转染miRNA-30c-inhibitor后BCL9的表达较NC组降低；而在永生化的GES-1细胞系中，转染miR-30c-mimic后，BCL-9表达较NC组均有所降低，但转染miR-30c-inhibitor后，BCL-9表达增高较NC组明显升高。 （7）免疫组化检测结果显示，胃癌组织中BCL-9、GJA1的表达与肿瘤分化程度、浸润深度、是否有淋巴转移、是否有脉管侵犯等临床资料无关（P>0.05）。 结论： （1）miR-30c在胃癌组织中呈低表达，并通过改变细胞增殖、凋亡和细胞周期参与胃癌的发生、发展。 （2）miR-30c表达下调水平与患者年龄相关。 (3)miR-30c对BCL9的调节关系在不同分化细胞系中影响不一，可能是多种因素综合作用所致，具体机制有待进一步研究。