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谷胱甘肽S-转移酶(GST)作为动植物体内的解毒酶常用作肿瘤标志物、环境监测、药物靶点等。另外GST还是一种水溶性好,尺寸大的标签蛋白,广泛应用于融合蛋白的分离纯化。因此,GST的分离纯化是关乎科学研究进展和基因工程产业化的一个重要技术。本文从材料角度出发,致力于开发制备方法简单、高效、价廉的GST分离材料。主要工作如下:
1.采用分散聚合技术,制备聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)微球,微球与乙二胺进行反应得到端基带氨基的微球,原位生成Fe3O4磁性纳米粒子后再通过1,4-丁二醇二缩水甘油醚连接配体谷胱甘肽(GSH)。通过SEM、FT-IR、XRD、VSM、元素分析、电位滴定等方法表征材料成功制备,尺寸均匀,呈规则球形,约1.3μm,具有超顺磁性,GSH键合量为71.5μmol/g。
2.采用溶剂热法制备Fe3O4微球,经HCl处理后水解正硅酸乙酯(TEOS)可形成SiO2包裹层。根据我组前人工作合成聚半胱氨酸,通过戊二醛可将其连接到氨基化Fe3O4@SiO2微球表面,再通过二硫代吡啶将配体GSH连接到聚半胱氨酸上。通过SEM、FT-IR、XRD、VSM、元素分析等方法表征材料成功制备,微球尺寸约325nm,尺寸均匀,具有超顺磁性且饱和磁化强度达70emu/g,SiO2层厚度约为20nm,聚半胱氨酸聚合度约为21,最终GSH键合量达25.1μmol/g。
3.通过甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)与葡聚糖上羟基反应制备双键修饰的葡聚糖,通过高内相乳液(HIPE)聚合修饰的双键制备多孔葡聚糖材料,在聚合过程中通过GSH巯基发生的链转移反应,将GSH在聚合过程中直接键合到材料上,无需再后续修饰,为改善材料机械强度,引入苯乙烯、异丙基丙烯酰胺、丙烯酸等单体共聚。通过SEM、压汞仪、元素分析等方法对材料进行表征,同时改变反应条件对材料进行优化,制备得到具有良好的硫含量、贯穿孔径、孔隙率和渗透性的GSH修饰的多孔葡聚糖材料,经过丙烯酸改性材料压缩模量可达1.0±0.49MPa,压缩形变达95.5±2.13%,硫元素含量达335.6μmol/g。
4.采用吉林大学提供的菌种成功诱导表达GST蛋白。采用前文制备的材料对细菌中表达的GST蛋白进行分离,分离效率在l-2mg/g之间,对肝脏组织破碎液中GST蛋白进行分离,结果与商品化柱子分离量基本相同,实验证明我们制备的材料具有分离GST蛋白能力。但是也存在一些问题,包括PGMA微球和Fe3O4@SiO2微球产量不大,只适用于小规模快速分离蛋白使用;Fe3O4@SiO2微球二硫键连接不稳定;多孔材料虽然容易制备,可以大量生产,结构也稳定,但是目前还没有发挥最优的分离效率,需要进一步优化分离操作的条件。