论文部分内容阅读
本课题观察体外单用及联合使用抗病毒药物对H5N1的抗病毒作用，旨在了解广东分离的HPAIV药物敏感性情况及不同毒株之间药物敏感性的差异，进一步了解抗病毒药物对本地区分离的H5N1的抗病毒活性。
材料和方法：
1．实验材料
1．1药物：金刚烷胺、达菲，分别配制成10mg/ml储存液，4℃保存。
1．2病毒：HPAIV H5N1亚型127、HPAIV H5N1亚型174毒株由华南农业大学禽病研究室惠赠，分离、鉴定和保存。
1．3细胞：幼犬肾(Madin-darby canine kindney，MDCK)细胞。细胞营养液：用Dulbeccos(MEM,GIBCO BRL)配制，含10﹪的小牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素。细胞维持液：含2﹪小牛血清的Dulbeccos MEM(GIBCO BRL)，其余同营养液。
2．实验方法
2.1 H5N1亚型AIV病毒毒力的测定：按Reed-Muench法计算AIV127及AIV174毒株的组织培养半数感染量TCID<,50>(Tissue culture infectious dose 50)。
2.2 药物对细胞毒性的测定：将药物作倍比稀释后加入细胞，最终以能维持细胞正常生长的最高稀释浓度作为该药物对细胞的安全浓度(即最大无毒浓度)，并按Reed-Muench法计算50﹪毒性浓度TD<,50>和最大无毒浓度TD<,0>。
2.3 金刚烷胺、达菲及两者联用体外对H5N1的影响：根据病毒、药物、细胞作用的不同方式，实验分三组。
药物浓度的设置：三组药物从TD<,0>开始对倍稀释共10个浓度。每一浓度4孔，每孔50ul。同时设正常对照组，病毒对照组。正常对照组只加细胞维持液，病毒对照组只加100TCID<,50>的病毒液，每孔50ul。
2.3.1药物对病毒的治疗作用(治疗给药方式)：即细胞先感染病毒后加药，探讨药物对细胞内病毒复制的抑制作用。
2.3.2药物对病毒的直接作用(直接作用给药方式)：即药物与病毒先作用一段时间后再感染细胞，探讨药物对病毒的直接杀伤作用。
2.3.3药物对病毒的预防作用(预防给药方式)：即药物先加入细胞后再感染病毒，探讨药物对病毒吸附细胞的阻断作用。
选择细胞病变效应(Cytopathic Effect，CPE)、病毒的HA效价及病毒的TCID<,50>作为评估病毒量的指标，判断药物疗效。
2.4 MDCK细胞内AIV血凝素(HA)的测定：按抗流感病毒HA试验常规操作。
2.5 MDCK细胞内AIV的TCID<,50>测定：按：Reed-Muench法计算病毒的TCID<,50>。
2.6统计学方法：采用SPSS11.5统计软件包进行统计学描述和分析，P<0.05为差异有统计学意义。
结果：
1.AIV127、AIV174两毒株病毒毒力的测定按Reed-Muench法计算半数感染量TCID<,50>，AIV127株的TCID<,50>=10<-6.5>/0.2ml，AIV174株的TCID<,50>=1O<-6.75>/0.2ml。
2.药物对MDCK细胞毒性实验金刚烷胺的TD<,0>=2<-5>×10mg/ml，达菲的TD<,0>=2<,-6>×10mg/ml，金刚烷胺联合达菲的TD<,0>=2<-6>×10mg/ml。
3.抗病毒药物体外对H5Nl的影响
3.1 抗病毒药物体外对It5Nl的治疗作用实验结果表明，三组抗病毒药物体外抑制MDCK细胞内H5Nl的复制有显著性差异(P<0.01)，其中达菲抑制M=DCK细胞内病毒复制效果明显强于金刚烷胺(P<0.01)，联合用药比单用金刚烷胺或单用达菲时抑制MDCK细胞内H5N1病毒复制效果更明显(P<0.05)。
3.2 抗病毒药物体外对H5N1的直接杀伤作用实验结果表明，三组抗病毒药物体外直接杀伤H5N1作用有显著性差异(P<0.01)，其中达菲的效果明显强于金刚烷胺(P<0.01)，联合用药比单用金刚烷胺效果明显(P<0.01)。
3.3 抗病毒药物体外对H5Nl的预防作用实验结果表明，三组抗病毒药物体外对H5Nl吸附MDCK细胞的阻断作用有显著性差异(P<0.01)，其中达菲的效果明显强于金刚烷胺(P<0.01)，联合用药比单用金刚烷胺效果明显(P<0.01)。
4.抗病毒药对H5N1感染所致MDCK的CPE动态观察结果表明，无论何种给药方法，金刚烷胺组在0-24h抑制病毒复制效果最强，24-48h开始出现CPE。而达菲组及联合用药组在72h后才出现轻度CPE。
5.比较三组抗病毒药物在不同的给药方法时对H5N1的抑制作用实验结果表明，三组抗病毒药对于三种不同的给药方式(方式Ⅰ：治疗给药；方式Ⅱ：直接作用；方式Ⅲ：预防给药)，体外对H5N1的抑制作用存在着一定差异，提示不同的药物抑制病毒复制的主要途径有所不同。对于金刚烷胺，可能主要通过直接杀伤病毒方式体外抑制H5N1的复制(P<0.01)。对于达菲，可能主要通过直接作用病毒或者阻断病毒吸附细胞的作用途径体外抑制H5N1的复制(P<0.01)。对于联合用药，可能主要通过抑制MDCK细胞内H5N1复制的途径，从而发挥抗病毒作用(P<0.01)。
6.抗病毒药物对同一亚型H5N1 AIV不同毒株的生物选择性-实验结果表明，三组抗病毒药物(在无毒范围内)，体外抑制115N1亚型AIV127株病毒复制的效果比AIV174毒株明显(P<0.01)。
结论
1.金刚烷胺、达菲及两者联合使用体外对H5N1亚型AIV毒株有抑制病毒复制的作用。其中达菲较金刚烷胺效果明显；两者联用比单用金刚烷胺效果明显；在先感染病毒后给药的方式下，两者联合比单用达菲效果明显。
2.金刚烷胺主要通过直接接触病毒的途径，抑制H5Nl亚型AIV复制，发挥抗病毒作用；达菲主要通过直接杀伤病毒或直接阻断病毒吸附细胞表面的途径，发挥抗病毒作用；两者联合主要通过抑制细胞内病毒复制的途径，达到治疗病毒感染的作用。
3.抗病毒药物对不同的禽流感病毒毒株之间敏感性存在差异，应根据不同毒株给予相应的抗病毒治疗。