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对本实验室自主筛选的乳链菌肽产生菌Lactococcus lactis G7进行了鉴定,并将菌株分别进行超声波诱变、硫酸二乙酯诱变和复合诱变,筛选得到3株产量提高的菌株(S-1、D-1及F-1),并对其进行基因组重排,获得1株遗传稳定性较好且产量有较大幅度提升的突变株R2-6,同时对该菌株的乳链菌肽发酵条件进行了初步优化。
通过菌种特性研究,确定采用菌龄为对数期的菌体进行诱变处理。通过致死曲线的测定,确定了超声波诱变时间5 min,0.8％硫t酸二乙酯诱变时间15min,进行复合诱变时,同时施加免疫压力,并确定液体培养基中最佳乳链菌肽添加量为6000IU/ml。出发菌株分别经超声波诱变、硫酸二乙酯诱变和复合诱变,采用平板初筛和发酵液复筛,获得3株乳链菌肽产量提高的菌株S-1、D-1和F-1。
对菌种原生质体制备及再生的影响因素进行了考察,确定采用菌龄为4 h的菌体,酶解时溶菌酶浓度为10mg/mL,37℃酶解2h,渗透压稳定剂为0.5 mol/L的蔗糖,再生培养方式采用双层平板再生。对原生质体灭活标记条件进行了研究,确定紫外灭活120s,60℃热灭活20 min后原生质体灭活率达100％。对原生质体融合条件进行了研究,确定融合条件为采用浓度为35％的PEG6000为助融剂,融合温度为37℃,融合时间10 min。
采用多母本原生质体递进融合技术,经过两轮改组后筛选得到1株乳链菌肽产量有大幅提升的突变株R2-6,较原始菌株G7提高了69.8％。
初步考察了突变株的发酵性能,采用正交试验对碳源、起始pH、装液量和金属离子不同浓度下产乳链菌肽最佳条件进行优化。实验结果表明四个因素对发酵的影响程度顺序为:Mg2+>装液量>葡萄糖>起始pH,可见金属离子是影响乳链菌肽产生和产量的主要因子,其次是装液量和葡萄糖。最终确定发酵条件是:葡萄糖1％、起始pH7.0、装液量40ml、Mg2+1.5ml(1mol/L)。