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目的:1、观察重组腺病毒载体Ad5FIIBs感染人脂肪来源的间质充干细胞(Human adipose derived mesenchymal stem cells，HAMSCs)的效率及细胞毒性；探讨Ad5FIIBs应用于lHAMSCs介导的基因治疗的可行性。2、体外及体内观察表达外源性Kringlel-5(KI-5)蛋白的HAMSCs(K1-5-HAMSCs)对内皮细胞血管活性的影响。3、将外源性K1-5基因导入HAMSCs后，观察其对TNFa促HAMSCs分泌VEGF及表达磷酸化JAK2和STAT3蛋白的影响。4、通过荷瘤鼠模型评价KI-5-HAMSCs对卵巢癌肿瘤生长及微血管形成的影响，探讨表达外源性Kringlel-5(K1-5)蛋白的HAMSCs治疗卵巢癌的可行性并筛选出有效的监测抗血管生成疗效的指标。
方法：1、胶原酶消化法从脂肪组织中提取成纤维样细胞，通过观察其生长特性及脂肪细胞和成骨细胞分化实验进行MSCs鉴定。通过绘制生长曲线观察其扩增能力。2、不同感染复数(MOI)下用重组腺病毒载体Ad-KI-5及Ad-Mock分别感染HAMSCs至48小时；应用荧光显微镜观察转染效率；检测感染Ad-Mock的HAMSCs (Mock-HAMSCs)和感染Ad-K1-5的HAMSCs(K1-5-HAMSCs)的倍增时间(DT)、分化潜能以及报告基因EGFP的表达时间。3、MOI为20时，提取两种转基因HAMSCs的总RNA，RT-PCR方法检测感染Ad-KI-5的HAMSCs(KI-5-HAMSCs)中Kringle1-5基因mRNA表达情况；Western blotting方法检测浓缩的Mock-HAMSCs和KI-5-HAMSCs条件培养液(Mock-CM和KI-5-CM)中的Kringlel-5蛋白水平。4、MTT法及基质胶体外血管生成实验检测未转基因HAMSCs浓缩条件培养液组(CM)、Mock-CM组和K1-5-CM组体外HUVECs增殖及管样结构形成情况，PBS干预作为空白对照组。5、建立裸鼠基质胶栓模型，定量分析观察Mock-CM组和KI-5-CM组基质胶栓内血红蛋白(Hb)的水平。6、收集并浓缩TNFa作用36小时的未转基因及转基因HAMSCs条件培养液，同时提取细胞总蛋白。ELISA方法检测各组HAMSCs条件培养液中VEGF的表达情况；蛋白印记方法检测各组HAMSCs中JAK2和STAT3磷酸化表达情况。7、建立卵巢癌裸鼠皮下移植瘤动物模型，与第五天时在肿瘤细胞移植部位定期注射Mock-HAMSCs和K1-5-HAMSCs进行干预治疗。观察两组移植瘤的大小。采用实时灰阶超声微泡造影观察荷瘤鼠肿块血管增强情况并绘制时间强度曲线。分析时间强度曲线中各参数的变化。检测两组瘤重情况。采用免疫组织化学方法检测各组荷瘤鼠卵巢癌肿块内vWF表达。
结果：1、从人脂肪组织成功地提取及培养出具有贴壁生长并具有向脂肪和成骨分化能力的成纤维样细胞，证明是HAMSCs。该细胞可传至10代。2、筛选出Ad5FllBs感染HAMSCs的最佳MOI为20。此MOI条件下，转染率达90％以上。与未转染组相比，细胞增殖能力无变化；转基因HAMSCs仍具有分化能力。表达外源性EGFP蛋白达28天。3、KI-5-HAMSCs组中Kringlel-5基因的mRNA呈强阳性表达；显著高于对照Mock-HAMSCs组（p<1.01）。K1-5-CM组中Kringlel-5蛋白的表达阳性，而Mock-CM组中无表达。4、与PBS对照组相比，HAMSCs条件培养液CM促进了HUVECs体外增殖及管样结构形成（p<0.05)，而KI-5-CM抑制了管样结构形成（p<0.05)。5、与Mock-CM组相比，K1-5-CM抑制了荷瘤鼠体内基质胶栓内Hb水平（p<0.01）。6、TNFa促进了HAMSCs分泌VEGF (p<0.01)。与Mock-HAMSCs组相比，KI-5-HAMSCs抑制了VEGF的分泌（p<0.01）。7、TNFa增加了HAMSCs磷酸化JAK2蛋白和STAT3蛋白的表达(p<0.05)。而KI-5-HAMSCs磷酸化JAK2和STAT3表达降低（p值均<0.05）。8、与Mock-HAMSCs组相比，KI-5-HAMSCs明显延缓卵巢癌皮下移植瘤的生长(p<0.5)；K1-5-HAMSCs组移植瘤肿块内MVD明显减少。8、与Mock-HAMSCs组相比，K1-5-HAMSCs组峰强度(PI)，绝对强度增量(ARI)，上升斜率(Sr)及曲线下的面积(AUC)明显减小（P<0.01）。
结论：1、人脂肪组织中存在具有高度扩增能力的MSCs。2、在感染复数为20时，重组Ad5FIIB可高效感染HAMSCs，对HAMSCs的细胞生物学活性无明显影响。3、MOI20时，感染Ad-KI-5的HAMSCs能表达K1-5蛋白。4、MOI20时，表达外源性Kringlel-5蛋白的HAMSCs可抑制内皮细胞体外及体内血管活性。5、TNF a能够促进HAMSCs释放VEGF及上调活化的JAK2和STAT3蛋白表达。6、MOI20时，表达外源性Kringlel-5蛋白的HAMSCs能够延缓卵巢癌皮下移植瘤生长及微血管生成。7、实时扶阶超声造影相关参数中，PI、ARI、Sr和AUC可能成为抗卵巢癌血管生成治疗疗效判定的灵敏指标。