【摘 要】
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该实验以拟南芥(Arabidopsis thaliana,Columbia ecotype)为材料,利用RNA干涉技术,试图通过对特异基因表达的抑制,获得CAT3基因沉默突变体,为进一步研究拟南芥CAT3的生物学功
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该实验以拟南芥(Arabidopsis thaliana,Columbia ecotype)为材料,利用RNA干涉技术,试图通过对特异基因表达的抑制,获得CAT3基因沉默突变体,为进一步研究拟南芥CAT3的生物学功能和SA诱导的H<,2>O<,2>的信号机制提供基础.得到以下结果:首先用生物信息学方法对拟南芥、烟草、玉米、水稻、Pumpkin等植物的各种CAT蛋白编码序列进行分析,结果显示,拟南芥CAT3和烟草CAT2具有较高的同源性,结合已有基因序列特征推测,他们可能具有相似的生物学功能.从拟南芥CAT3上挑选合适的基因片段,在全基因组中进行BLAST,确定用于构建基因沉默载体的目的片段的大小和位置.利用PCR,从野生型拟南芥基因组中克隆出CAT3上的一段序列(约450bp),再分别将这一基因片段先后以反向和正向插入双源载体Pfgc5941的两个多克隆位点中,结果显示,已构建出一个ihpRNA沉默结构的遗传载体Pfgc5941cat3ds.将该重组质粒转入农杆菌LBA4404菌株,利用PCR筛选出了转化菌株.Floral dip法转化野生型拟南芥植株后,收获转化种子.用PPT筛选潜在的第二代转基因植株,得到了14棵转化株.分别在光照、黑暗、ABA(10<-4>mol/L)(黑暗)和SA(10<-3>mol/L)(黑暗)条件下处理野生型拟南芥幼苗,提取总RNA后,再反转录出cDNA,以此为模板,检测CAT3 mRNA转录水平的变化.结果显示:黑暗处理可诱导CAT3 mRNA转录水平的升高,ABA处理后几乎没变化,而SA处理可部分抑制暗诱导所引起的CAT3 mRNA转录水平的升高.这说明拟南芥CAT3的转录受暗诱导表达,同时受SA的抑制.
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