急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction，AMI)是由冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死，它是影响我国人民健康的主要疾病之一。心肌梗死后心肌细胞大量丢失，炎症反应加剧，梗死心肌逐渐被纤维疤痕组织代替，加上心肌细胞再生能力有限，因此梗死后的心脏无法通过自身的修复机制实现血运重建来减少心室重构从而改善心脏功能，这使得干细胞移植成为近年来心肌梗死的新兴治疗策略。　　骨髓组织中存在大量的干细胞和祖细胞，它们能够分化成为利于病损组织修复的细胞类型，大量实验及临床研究也发现，骨髓细胞的移植能够显著改善心肌梗死后心脏功能，而移植时机的选择是影响移植疗效的重要因素，目前认为AMI后一周左右为最优移植时间，本实验前期对临床资料进行汇总分析显示，AMI后一周进行细胞移植与24小时开展移植相比，其疗效和安全性可能更佳[9]。近年来，除影响干细胞生物行为（增殖、生存、分化等）的生化因素外，影响干细胞特异表型的物理微环境（主要是基质弹性或硬度）日益受到关注，因为细胞外基质硬度决定了干细胞的分化方向和生物学功能。我们前期研究结果发现，梗死心肌硬度存在先降低后逐渐增高的时间依赖性变化，MI后7-14天梗死心肌物理微环境（即心肌硬度）或更适宜移植细胞向益于心脏修复的细胞类型分化[9，12,13]。　　故本研究利用聚丙烯酰胺凝胶这一弹性基质，按照不同的配比浓度，实现梗死后不同时间点心肌硬度的体外模拟，并以此基质作为基底，于体外构建软基底细胞培养体系（4kPa模拟MI后24h心肌硬度:15kPa模拟MI后1h心肌硬度;42kPa模拟MI后7-14d心肌硬度;72kPa模拟MI后14-28d心肌硬度），将通过密度梯度离心法和免疫磁珠分选法分离获得的小鼠骨髓CD34+细胞于软基底培养体系中培养7d后，借助细胞免疫荧光染色和激光共聚焦显微镜，从细胞表型和细胞骨架角度探讨心肌样弹性基质诱导小鼠骨髓CD34+细胞向内皮系细胞分化的作用差异。　　实验结果发现，42kPa这一基质胶上（模拟MI后7-14天心肌硬度）存活的内皮系细胞数量与其他三种基质胶相比具有显著的统计学差异(p＜0.01)。不同硬度基质胶在诱导小鼠骨髓CD34+细胞向内皮系细胞分化效率方面（ac-LDL/UEA-1双阳性率）无统计学差异。此外，42kPa基质胶上内皮系细胞表面标记物vWF和CD31的表达率与其他基质胶相比，也具有极显著统计学差异(p＜0.001)。细胞骨架染色发现，4kPa和15kPa基质胶上的小鼠骨髓CD34+细胞在培养7天后，细胞铺展呈近圆形，边缘有黏着斑形成，片状伪足边缘有F-actin聚集并形成波纹型的骨架，而42kPa和72kPa基质胶上诱导分化的EPC，细胞形态大多呈梭型，黏着斑呈片状分布在细胞边缘，胞体内也形成明显的微丝骨架。综上，不同弹性基质促使小鼠骨髓CD34+细胞向内皮系细胞分化的的效率不同，42kPa这一弹性基质与其他三种基质胶相比更具优势。　　第一部分 在弹性基质上开展小鼠骨髓CD34+细胞培养的可行性研究　　目的：利用聚丙烯酰胺凝胶这一弹性基质，体外模拟心肌梗死后不同时间点心肌硬度，构建软基底细胞培养体系，为探讨梗死心肌样弹性基质对移植细胞的分化诱导作用提供研究基础。　　方法：利用聚丙烯酰胺凝胶作为弹性基质，于体外构建软基底细胞培养体系，模拟MI后不同时间点心肌硬度(4kPa模拟MI后24h心肌硬度;15kPa模拟MI后1h心肌硬度;42kPa模拟MI后7-14d心肌硬度;72kPa模拟MI后14-28d心肌硬度），凝胶表面经活化处理，纤连蛋白包被以及系统平衡后开展细胞培养。利用密度梯度离心法和免疫磁珠分选法分离获得BALB/c小鼠骨髓CD34+细胞，将细胞铺于软基底细胞培养体系中，用含20％FBS，2.5ng/ml VEGF的M199培养液进行培养，首次72小时换液，之后每48小时换液一次，于倒置显微镜下观察细胞生长状态。　　结果：小鼠骨髓CD34+细胞可以存活在不同硬度的弹性基质胶上，细胞随时间变化逐渐铺展在胶面上，并且生长状态良好。　　结论：弹性基质上进行小鼠骨髓CD34+细胞培养切实可行，可以此为工作基础探讨弹性基质对小鼠骨髓CD34+细胞分化的诱导作用研究。　　第二部分 弹性基质诱导小鼠骨髓CD34+细胞分化后细胞表型差异的研究　　目的：梗死心肌物理微环境（即硬度或弹性）可影响移植细胞分化方向，本研究借助小鼠骨髓CD34+细胞培养，从细胞表型角度探讨梗死心肌样弹性基质在诱导骨髓CD34+细胞向内皮系细胞分化中的作用。　　方法：8周龄BALB/c雄性小鼠，体重22-25g，颈椎脱臼法处死后取两后肢长骨，用PBS冲洗骨髓腔以制备单细胞悬液。利用密度梯度离心法和免疫磁珠分选法分离获得小鼠骨髓CD34+细胞，将细胞铺于不同硬度的软基底细胞培养体系中(各基质硬度分别为:4kPa，15kPa，42kPa和72kPa)，诱导分化培养7天后借助细胞免疫荧光染色和激光共聚焦显微镜，经细胞计数和统计分后，分别比较小鼠骨髓CD34+细胞在不同基质胶上Dil-ac-LDL/FITC-UEA-1双染色阳性细胞数量和比例，比较内皮系标志物CD31和vWF的表达差异，从细胞表型角度探讨弹性基质诱导小鼠骨髓CD34+细胞向内皮系细胞分化的作用差异。　　结果：统计结果显示，42kPa（模拟MI后7-14天心肌硬度）基质胶上Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1双染色阳性细胞数量与其他三种基质胶相比具有显著性统计学差异，p＜0.01。但是不同硬度基质胶在诱导小鼠骨髓CD34+细胞向内皮系细胞分化效率（即ac-LDL/UEA-1双染色阳性比例）无显著统计学差异。此外，42kPa基质胶上内皮系标志物CD31和vWF的表达与其他基质胶相比，均具有极显著的统计学差异(p＜0.001)。　　结论：42kPa这一基质硬度更有利于小鼠骨髓来源的CD34+细胞向内皮系细胞类型分化。　　第三部分 弹性基质诱导小鼠骨髓CD34+细胞分化后细胞骨架变化的研究　　目的：细胞可以感受周围的化学环境（如VEGF）或者物理环境（如硬度）变化，从而改变细胞形态、细胞骨架等。本研究借助小鼠骨髓CD34+细胞培养，从细胞骨架角度探讨梗死心肌样弹性基质在诱导小鼠骨髓CD34+细胞向内皮系细胞分化的作用。　　方法：8周龄雄性BALB/c小鼠，体重22-25g，颈椎脱臼法处死后取两后肢长骨，用PBS冲洗骨髓腔以制备单细胞悬液。利用密度梯度离心法和免疫磁珠分选法分离获得小鼠骨髓CD34+细胞，将细胞铺于不同硬度的软基底培养体系中(各基质硬度分别为:4kPa，15kPa，42kPa和72kPa)，诱导分化培养7天后借助细胞免疫荧光染色和激光共聚焦显微镜，比较小鼠骨髓CD34+细胞经基质胶诱导分化后细胞骨架排列差异，从细胞骨架角度探讨弹性基质诱导小鼠骨髓CD34+细胞向内皮系细胞分化的作用差异。　　结果：细胞骨架染色发现，4kPa和15kPa基质胶上的CD34+细胞在培养7天后，细胞铺展呈近圆形，边缘有黏着斑形成，片状伪足边缘有F-actin聚集并形成波纹型的骨架,而42kPa和72kPa基质胶上诱导分化的EPC，细胞形态大多呈梭型，黏着斑呈片状分布在细胞边缘，胞体内也形成明显的微丝骨架。但是42kPa与72kPa基质胶上的细胞相比，细胞形态更加舒展，面积更大，胞体内的微丝骨架更明显。　　结论：42kPa这一基质胶与其他三种基质胶相比，能使CD34+细胞更快的进行细胞铺展，或能发挥最优的诱导分化作用。