K562细胞系是一种人红白血病细胞系,它基本处于造血干细胞分化的髓样祖细胞阶段而停止继续分化,但具有双向分化潜能,在氯高铁血红素(Hemin)等试剂的诱导下可以向红系分化,而在肉豆蔻佛波酯(PMA)的诱导下则可以向巨核系分化.这些分化与不同基因的表达或抑制密切相关.Liang和Pardee发明的差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)技术<[1]>一直被视为筛选新基因的重要方法之一,但它存在假阳性率偏高和重复性较差的缺陷.为解决此问题,我们参照Martin和Pardee的改进方案<[3]>,建立了一种使用长引物,进行二步PCR的改进DDRT-PCR方法.以氯高铁血红素(Hemin)和肉豆蔻佛波酯(PMA)分别诱导K562细胞36h使之分别向红细胞和巨核细胞分化,取诱导前后的细胞制备总RNA,用3个3mRNA锚定引物及6个5mRNA随机引物进行了18种组合PCR扩增,获得与K562细胞向红系分化相关的差异cDNA片段60条,其中38条分化后表达上调,22条分化后表达下调;获得与K562细胞向巨核系分化相关的差异cDNA片段120条,其中46条分化后表达上调,72条分化后表达下调.选择43条与巨核细胞分化相关的差异带(26条在PMA诱导的K562细胞中表达上调,17条PMA诱导的K562细胞中表达下调)进行PCR再扩增、纯化回收,以PUC19质粒为载体对差异EST序列进行克隆、提取重组质粒DNA并测序.然后通过基因信息分析与GenBank数据[包括GenBank非冗余数据库(nr)、EMBL、DDBJ、PDB、high-throughout gene screenign(htgs)、dbEST、GSS]中的核苷酸序列进行同源性比较.发现20个EST与GenBank中已知蛋白的cDNA高度同源(包括调控因子或信号因子9条,线粒体或核糖体组分2条,假设蛋白3条,血小板特异表达的蛋白1条),15个与已知EST或cDNA片段有同源性,2个为新EST.