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目的：在建立慢性酒中毒动物模型和体外细胞模型的基础上，探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)能否改善慢性酒中毒大鼠的认知功能损害以及MSCs条件培养基(MSCs conditioned medium，MSC-CM)是否能对慢性酒精暴露造成的脑神经细胞损害起到保护作用，通过体内、体外两条途径证明骨髓MSCs治疗慢性酒中毒性脑损害的可能性；并阐述其相关的作用机制。
方法：体内实验：雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠通过高浓度酒精(50％)逐渐加量灌胃8周，建立慢性酒中毒动物模型。将实验大鼠(n=32)随机分为对照组、慢性酒中毒组、MSCs回输治疗组和PBS(phosphate buffered solution)回输组。体外分离、培养、扩增并鉴定SD大鼠骨髓MSCs，并以慢性酒中毒动物模型为研究对象，分别以荧光染料PKH-26膜标记的MSCs(107个细胞/只)或者PBS经尾静脉进行移植。通过Morris水迷宫检测评定认知功能；荧光显微镜进行MSCs示踪观察；免疫印迹法检测各组大鼠海马抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的表达；比色法检测各组大鼠海马组织氧化应激指标[超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)，丙二醛(malondialdehyde，MDA)]的含量；免疫组化、RT-PCR(Reverse transcription-ploymerase chain reaction)和免疫印迹法比较各组大鼠海马神经生长因子(Nerve growth factor，NGF)和脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)的表达；免疫印迹法检测各组大鼠海马信号通路PI3K/Akt(phospha-tidylinositol-3-kinase/Akt)和ERKl/2(extracellular signal-regulated kinase l/2)中转导分子p-Akt和p-ERKl/2的表达。
体外实验：培养PC12细胞；分离、纯化并培养原代皮质神经元细胞。在体外培养骨髓MSCs的基础上，收集MSCs条件培养基(MSCs conditioned medium，MSC-CM)。PC12细胞和原代皮质神经元分别在存在或不存在酒精暴露(100mM)的情况下，预先给予或不给予MSC-CM进行干预，共培养4天。通过MTT和LDH方法检测细胞活性；细胞核DAPI染色法和Annexin V/PI双染的流式细胞术检测细胞凋亡的情况；流式细胞术和比色法检测不同处理的细胞内氧化应激指标[SOD、GSH、MDA和活性氧自由基(Reactive Oxygen Species,ROS)]的活性；ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)法检测MSC-CM中营养因子的含量；免疫印迹法检测不同处理的细胞内信号转导分子p-Akt和p-ERK1/2的表达情况。另外，通过添加上述两条信号通路的阻断剂，进一步证实MSC-CM抗氧化作用的相关分子机制。
结果：体内实验：(1)Morris水迷宫实验中，MSCs回输治疗组各时间点逃避潜伏期[(33.83±3.26)s，(13.14±2.64)s，(6.53±0.98)s，(4.45±0.85)s]明显短于慢性酒中毒组[(53.78±4.29)s，(36.53±2.39)s，(18.28±2.13)s，（8.67±0.46）s](P<0.01)；平台象限时间百分比(73.99±1.49％)明显长于慢性酒中毒组(51.25±3.69％)(P<0.01)，显著改善了慢性酒中毒模型鼠的学习记忆功能(P<0.01)，且与对照组无显著差异（P>0.05）。(2)以PKH-26红色荧光标记的MSCs示踪实验发现，MSCs可向慢性酒中毒鼠海马内趋化。(3)与对照组相比，慢性酒中毒鼠海马抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显降低(P<0.01)，促凋亡蛋白Bax表达明显升高(P<0.01)：而MSCs回输治疗明显降低了慢性酒中毒鼠Bax的表达(P<0.01)，提高了Bcl-2的表达(P<0.01）。(4)与对照组相比，慢性酒中毒鼠海马内MDA的含量明显增高(P<0.01)，SOD和GSH的活性明显降低(P<0.O1)；而MSCs回输治疗能够明显抑制慢性酒中毒造成的大鼠海马氧化应激指标的恶化(P<0.01)。(5)RT-PCR结果显示慢性酒中毒鼠海马中NGF和BDNF mRNA表达比对照组明显降低(P<0.01)，而MSCs治疗后可使两者表达明显上调(P<0.01)，免疫组化和免疫印迹方法检测也得到了同样的结果。(6)与对照组相比，慢性酒中毒大鼠海马p-Akt表达明显降低(P<0.01)，而p-ERK1/2表达明显升高(P<0.01):MSCs回输治疗不仅能够明显逆转这些现象(P<0.01)，还进一步促进了PI3K/Akt通路的激活(P<0.01)。
体外实验：(1)MSC-CM能够明显增加慢性酒精暴露的PC12细胞和原代皮质神经元的活性(P<0.01)，减少细胞凋亡(P<0.O1)，并且能够明显抑制酒精造成的ROS、MDA的堆积和SOD、GSH的减少(P<0.01)，且均达到对照组水平(P>0.05)。(2)ELISA结果显示，MSC-CM内含有相当数量的NGF和BDNF。(3)长期酒精暴露可以引起两种细胞内p-Akt表达明显减少(P<0.01)，以及p-ERK1/2表达明显增加(P<0.01)；而MSC-CM不仅能够明显逆转这些现象（P<0.01），还进一步促进了PI3K/Akt通路的激活(P<0.01)。(4)PI3K通路阻断剂(LY294002)能够部分地抑制MSC-CM引起的细胞活性增加、凋亡减少以及改善氧化状态的作用(P<0.01)。ERK1/2通路阻断剂(PD98059)能够在一定程度上抵抗酒精暴露引起的细胞凋亡性死亡(P<0.O1)；但是PD98059却不能缓解酒精引起的氧化应激指标的变化(P>0.05)。
结论：(1)首次证实骨髓间充质干细胞治疗能明显缓解慢性酒中毒导致的大鼠认知功能障碍以及酒精暴露引起的体外培养的脑神经细胞的凋亡性损伤；(2)其作用机制可能通过自/旁分泌NGF和BDNF等营养因子刺激了组织和细胞内的抗氧化防御能力，从而起到抗氧化性保护作用；(3)骨髓间充质干细胞的抗氧化作用的分子机制部分是通过激活PI3K/Akt通路实现的；(4)同时，在证明了ERK1/2通路激活为慢性酒中毒氧化应激损伤的下游分子的基础上，证实骨髓间充质干细胞可能在启动抗氧化机制后抑制了ERK1/2通路的活化，从而起到保护作用。