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存活素(survivin)是由耶鲁大学的Altieri等在1997年发现的一种凋亡抑制因子(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs),具有强大的抗凋亡功能,属于凋亡抑制因子家族成员之一。人类的survivin蛋白是一类胞质蛋白,在大多数正常组织测不到其表达;而绝大多数癌组织存在survivin蛋白表达。顺铂(cisplatin,DDP)由于其抗肿瘤作用明显、价格低廉,并且可应用于多种肿瘤的化疗,是目前临床上最常用的化疗药物之一。近年来对肿瘤化疗药物的研究表明,某些肿瘤细胞在长期应用顺铂后出现药物疗效下降,同时可检测到survivin的高表达。本实验通过将人工合成的survivin siRNA经lip包裹后转染SGC7901细胞,探讨siRNA联合顺铂能否增强对SGC7901的抑制作用及诱导肿瘤细胞凋亡的能力,从而为临床胃癌的化疗开辟一条新路径。
目的:研究梯度浓度顺铂在不同时间下作用于SGC7901细胞,对其增殖抑制作用的影响;观察survivin siRNA转染SGC7901细胞后survivin表达的改变;检测细胞转染survivin siRNA联合顺铂对该细胞抑制作用和早期凋亡率的变化。
方法:细胞培养:SGC7901细胞常规培养于含有10％胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液中,置于37℃、.5％CO2、饱和湿度培养箱中。通过lip包裹人工合成的survivin siRNA转染SGC7901细胞,荧光显微镜下观察细胞形态及转染情况;MTT法检测各组肿瘤细胞的增殖抑制率(IR);免疫细胞化学染色(SP法)、免疫细胞荧光染色和Western blot分别检测survivin蛋白的表达情况;Hoechst33258染色观察细胞凋亡的形态及流式细胞仪(FCM)检测细胞早期凋亡率。
结果:
1.MTT检测结果:①顺铂对细胞的增殖抑制影响:与同时间点的control组相比,梯度顺铂组细胞增殖抑制率明显增高(P＜0.05);1.0mg/L顺铂作用细胞24h、48h及72h的增殖抑制率分别为(22.54±2.13)％、(37.44±4.56)％和(40.58±4.76)％,随着作用时间的延长,其增殖抑制率并没有明显上升,72h的增殖抑制率与48h的相比,差异无统计学意义(P＞0.05)。②转染survivin siRNA对细胞也有一定的增殖抑制作用,其作用强于lip组(9.19±1.48)％和siRNA组(5.00±1.55)％(P＜0.05)。③转染survivin siRNA联合1.0mg/L顺铂组作用细胞后72h,其增殖抑制率(63.93±4.22)％明显高于单用顺铂组(42.97±2.73)％和转染组(19.16±1.65)％,差异有统计学意义(P＜0.05)。
2.免疫细胞荧光染色结果显示:转染survivin siRNA后,细胞中survivin蛋白表达明显少于control组、lip组和siRNA组。
3.survivin蛋白表达的变化情况:①免疫细胞化学染色:与相同时间点control组相比,转染siRNA组和转染survivin siRNA联合顺铂组细胞中survivin蛋白的表达明显降低(P＜0.05),而顺铂组survivin蛋白的表达升高(P＜0.05);顺铂组作用细胞后72h,细胞中survivin蛋白表达明显高于作用细胞后48h(P＜0.05)。②Westernblot检测结果显示:顺铂组作用细胞后,细胞中survivin表达量明显高于control组,而顺铂作用细胞后72h,细胞中survivin蛋白的含量高于作用细胞48h。差异均有统计学意义(P＜0.05)。
4.各组细胞经处理后72h凋亡检测结果:①Hoechst33258荧光染色法结果显示:顺铂和转染siRNA作用细胞后72h都能诱导细胞的凋亡,镜下可见细胞核染色增强,核质浓缩、核碎裂,呈凋亡改变。②FCM检测结果显示:转染组和顺铂组作用细胞后72h细胞早期凋亡率分别为(11.90±1.16)％和(19.85±1.43)％,均低于联合作用组(33.92±2.01)％,差异有统计学意义(P＜0.05)。可见细胞转染survivinsiRNA后,能够明显增强顺铂诱导SGC7901细胞凋亡的能力。
结论:
1.顺铂和转染survivin siRNA都能够抑制SGC7901细胞的增殖。
2.转染survivin siRNA联合顺铂能够增强对SGC7901细胞的增殖抑制作用。
3.转染survivin siRNA能够下调survivin蛋白的表达。
4.转染survivin siRNA联合顺铂能够增强诱导SGC7901细胞凋亡的能力。