酶催化因其反应条件温和、环境友好，符合“绿色化学”概念，日益受到重视。自然界的野生型酶通常难以满足产业化对其催化性能的要求，需要经过分子改造提高各项催化性能。随机突变、定向进化和高通量筛选等改造技术因盲目、工作量大、效率不够高等原因已逐渐难以满足当前经济社会快速发展的要求，近几年随着计算机水平、结构生物学和计算生物学的迅猛发展，基于结构和机理认知的酶分子理性设计改造逐渐成为发展趋势。腈水解酶催化腈类合成羧酸，在有机合成方面起到重要作用，是重要的生物催化剂，实际生产中大多数野生型腈水解酶难以满足生产要求。然而，腈水解酶晶体结构的缺乏严重限制了腈水解酶催化机制的研究及其理性设计改造。本论文针对上述现象，以来源于Syechocystis sp.PCC6803的腈水解酶Nit6803为研究对象，通过蛋白结晶及X-射线衍射晶体解析技术获取腈水解酶晶体结构，利用虚拟突变、量化计算、分子对接、分子动力学模拟及QMMM计算等技术，探索了腈水解酶的催化机理、底物选择性机制、卤代底物位置选择性机制及酰胺/羧酸产物调控机制，在此基础上采用理性改造的手段实现了一系列的性能优化。以下是主要研究内容:　　本论文在大肠杆菌中成功实现了来源于Syechocystis sp.PCC6803的腈水解酶Nit6803的可溶表达及纯化鉴定，通过蛋白结晶及X-射线衍射技术获得了其晶体结构，并提交至PDB数据库(PDBID:3WUY)。通过序列比对、结构分析及定点突变实验，确定了其催化三联体E53-K135-C169。该腈水解酶结构为PDB数据库中第二个腈水解酶分支的酶分子晶体结构，为后续研究提供了结构和机理认知。　　腈水解酶依据底物选择性可分为脂肪族、芳香族和芳基乙腈类腈水解酶，然而由于结构的缺乏、机理的不明确，其底物选择性机制尚不明确。腈水解酶Nit6803底物谱涵盖脂肪族、芳香族和芳基乙腈类，是目前已经报道的天然腈水解酶中底物谱最广的酶，结合本论文获得的晶体结构，为腈水解酶的底物选择性机制研究提供了较好的体系。本论文通过与第一个腈水解酶结构进行比对，采用分子对接及分子动力学模拟技术结合定点突变实验，针对其底物选择性机制进行了细致研究。发现其W146位点通过π相互作用与周围氨基酸残基形成相互作用网络，这种相互作用进一步传递至催化中心，影响底物结合模式，从而实现对脂肪族底物和芳香族底物的选择性。　　本论文针对不同位置卤代化合物拆分困难问题，基于卤键作用机制分析，设计获得了突变体T54Y和H141W，能够分别选择性催化对-氯苯乙腈和邻-氯苯乙腈，实现了腈水解酶对邻、间、对位取代底物的选择性催化;揭示了其不同位置卤代底物的位置选择性在于卤键结合芳香相互作用形成相互作用网络影响了底物结合，进而影响了不同位置卤素取代底物的催化选择性。论文首次将卤键引入到酶分子催化改造中，并自主编写了卤键分析工具，为卤键在其他酶分子中的研究提供了借鉴。　　本论文围绕如何充分挖掘和利用酶催化剂的多功能实现目前亟待解决的产品合成，针对腈水解酶的多功能现象进行了研究，利用腈水解酶的腈水合酶活力实现了酰胺化合物的合成。该工作基于腈水解酶催化机理和NAC理论模型，采用量化计算和分子动力学模拟技术，理性设计改造获得了5个酰胺明显提高的突变体F193N、F193D、F193E、F193Q和F193A，其酰胺含量分别是野生型的35倍、31倍、26倍、25倍和20倍;解析了腈水解酶多功能反应调控机制在于催化过程中过渡态中间四面体上氨基与巯基的质子化竞争结果影响了产物中酰胺比例，而193位点以空间位阻的模式，影响周围氨基酸的构象、氢键、静电作用及芳香作用，进而影响了过渡态中间四面体上巯基和氨基的质子化竞争，最终影响产物中酰胺和羧酸的比例。首次采用理性设计的方法实现了腈水解酶到腈水合酶的切换，获得了一种新型的来源于腈水解酶的腈水合酶，为酰胺的合成提供了新思路，为酶分子新功能的挖掘提供了新方向。　　本论文针对腈水解酶催化机理中质子传递路径及其他具有争议的方面，如腈水解酶以催化三联体C-E-K还是催化四联体C-E-E-K的形式发挥功能等，采用量子化学-分子力学结合(QM/MM)的手段，计算了其势能垒、分析了其质子传递路径。发现腈水解酶的质子化过程为过渡态中间四面体上羟基氢传递到Lys135，随后再传递到Glu53，再进一步传递至底物氨基，从而生成产物羧酸。同时阐明了腈水解酶并不以C-E-E-K形式发挥催化功能，为后续研究者提供了相关理论支持。