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青霉素是广泛使用的一种抗生素,在帮助人类治疗病菌感染方面发挥了极其重要的作用。我国的青霉素原料盐产量居世界首位,但相比国外先进水平而言,青霉素生产的效价水平还存在一定的差距。目前,工业上仍然主要利用产黄青霉发酵获得青霉素。产黄青霉是丝状菌的一种,在发酵过程中,随着时间的推移和环境条件的改变,菌体形态会发生显著的改变。而青霉素作为次级代谢产物,其合成调控机制比较复杂,已有研究证实丝状菌发酵过程中,菌体形态和产物代谢之间存在密切联系。本文首先建立了一种有效获取菌丝形态的方法,并且通过软件实现对形态图像的处理,得到菌丝形态参数;随后对不同培养条件下菌体形态和产物代谢状况进行了研究并根据图像处理结果,建立形态动力学方程;最后从菌体的生理生化角度对形态和代谢之间的关系进行论述,为形态分析法在工业上的应用提供理论和实验基础。
1、建立了亚甲基蓝首染,石碳酸品红复染的染色方法,并且通过二值化、伪彩色增强等处理手段对菌丝形态图像进行处理,得到形态参数。复染的结果是:高活性区域主要呈现橘红色,随着活性的降低,颜色从紫色向蓝灰色渐变。通过对图像的处理可以得到菌丝总长、平均直径、分支数以及不同活性区域所占比例等形态特征参数。
2、比较了不同接种量、培养基成分、pn值以及发酵的容器环境对菌丝形态的影响。接种孢子浓度的上升有利于生物量的稳步提高,同时菌丝球直径减小。当孢子浓度为2×109～6×109个/L时,青霉素大量合成时菌丝球平均直径为380～400μm,浓度继续增大将加剧菌体自溶;以乳糖作为发酵碳源,当青霉素效价最高时,单个菌丝总长约为150～160μm,分支数约为1.5,此时菌丝生长单位HGU约为100μm,换以蔗糖作为碳源,同一时间段菌丝生长单位HGU比起乳糖低得多,不利于次级代谢的进行,而培养基中不添加碳酸钙会对菌丝球致密程度造成影响;pH影响菌丝空泡形态的比例,当空泡形态所占比例达到并超过20％时,青霉素合成开始大量进行,效价有显著提高;当青霉素效价达到最高值时,此时空泡比例大约在35%～40%;而当空泡过度膨胀,比例超过40%时,青霉素合成开始缓慢下降;在摇瓶发酵中,青霉素效价最高值出现在菌丝总长约为150μm,平均直径约为5.2μm时;3.7L发酵罐中,采用相同的培养基配方,尝试不同的转速和通气条件,在菌丝总长和平均直径基本保持不变情况下,青霉素效价与对照差距较大。
3、对摇瓶最优发酵条件下茵体生物量、青霉素合成、菌丝总长、分支数和空泡比例随时间变化曲线进行拟合,其中菌体生长利用Logistic方程,产物代谢和菌丝形态参数利用Luedeking-Piret方程。计算得到模型参数,拟合曲线与实验结果吻合度较好,对应用于工业生产具有一定的指导意义。