研究目的:脑卒中是引起人类死亡的三大原因之一,其高发病率、高死亡率、高致残率给社会和人民生活带来了巨大的负担。缺血性脑卒中由血管堵塞引起,约占脑卒中的80%以上。脑缺血涉及的机制十分复杂,如:兴奋性毒性、钙超载、氧化应激、炎症反应及凋亡等。其中炎症反应是引起神经元损伤的重要因素。小胶质细胞是中枢神经系统固有的免疫细胞,参与抗原呈递、吞噬及分泌促炎/抗炎因子等。众多研究表明小胶质细胞激活在中风后对脑组织损伤起到双向作用,这与其极化分型相关。小胶质细胞可以极化为经典激活的促炎的M1型(classically actived microglia)和选择性激活的抗炎的M2型(alternatively actived microglia)。而在脑缺血发病进程中,小胶质细胞的激活与极化与神经凋亡或修复有密切关系。因此,我们不应该简单地抑制小胶质细胞的激活,而应该促进小胶质细胞向具有神经保护作用的M2型转换,从而为缺血性脑卒中的治疗策略提供指导。单核细胞迁移抑制因子(monocyte locomotion inhibitory factor,MLIF)是一种由溶组织阿米巴分泌的、具有热稳定性的活性五肽。本课题组在前期研究中发现MLIF可以减少MCAO大鼠和小鼠模型的脑梗死面积,并可以通过作用于真核翻译延长因子1A1(eukaryotic elongation factor1A1,eEF1A1)上调bEnd3细胞中血管内皮一氧化氮合酶(eNOS)的表达,降低氧糖剥夺(oxygen and glucose deprivation,OGD)OGD和ox-LDL诱导的粘附分子ICAM-1、VCAM-1,发挥脑缺血血管保护作用。另外,我们还发现MLIF可以作用于eEF1A2而抑制由OGD诱导的神经细胞SH-SY5Y的凋亡发挥脑缺血神经保护作用。因此,本课题组在前期研究的基础上,进一步研究MLIF对小胶质细胞激活与极化的调控作用,阐明MLIF在脑缺血中的神经保护作用的抗炎机制,为脑缺血的防治提供新思路。方法与结果:1、建立BV2小胶质细胞体外缺氧模型,采用Conditioned Medium Transfer System方法,研究体外脑缺血模型中小胶质细胞对神经细胞的影响。将BV2小胶质细胞正常培养或OGD后的培养上清(conditioned medium,CM)分别加入正常或者OGD处理的SH-SY5Y神经细胞中,采用MTT检测细胞的生存率。结果显示,添加BV2细胞OGD后CM使SY5Y细胞的生存率下降,给予MLIF处理的CM后,提高了SY5Y细胞的生存率。2、利用Real-time PCR及ELISA检测MLIF在缺氧条件下对BV2小胶质细胞极化的调控作用。结果显示缺氧诱导了BV2小胶质细胞M1 markers(CD11b、CD32、cd86、inos、il-1β、tnf-a)mrna或蛋白的表达显著升高,给予mlif处理后明显下调;缺氧条件下,m2markers(arg-1、cd206、fizz-1、ym-1、il-4、il-10)mrna或蛋白的表达在给予mlif处理后显著上调。表明mlif促进ogd诱导的小胶质细胞m1型向m2型转化。3、采用mcao法制造大鼠、小鼠脑缺血模型。tunel染色检测大鼠缺血脑组织的细胞的凋亡情况,采用he染色和透射电镜技术观察大鼠缺血脑组织的病理显微结构及超显微结构的改变;real-timepcr与elisa检测大鼠缺血脑组织的激活的小胶质细胞m1markers及m2markers的表达。利用免疫荧光方法检测大鼠脑组织小胶质细胞的激活情况及小鼠缺血脑组织的激活的小胶质细胞m1markercd16/32及m2markercd206的表达。结果显示,mlif可抑制大鼠缺血脑组织细胞凋亡、改善大鼠缺血脑组织在显微结构及超显微结构上的病理改变,并可以抑制大鼠脑缺血后小胶质细胞的激活,抑制大、小鼠脑缺血后m1型markers的表达,促进m2型markers的表达,从而促进小胶质细胞从m1型向m2型转化。4、利用westernblot实验检测可能与mlif相关的nf-κb及mapk通路,结果显示mlif可以抑制ogd诱导的nf-κb通路的激活,而对mapk通路没有显著影响。5、利用蛋白间pull-down技术,研究mlif在bv2小胶质细胞中的结合蛋白。设置生物素标记的mlif组和阴性对照组,完成pull-down实验后,通过sds-page及考马斯亮蓝染色后在50kda处出现了一条清晰条带,经过westernblot验证,结果表明mlif在bv2小胶质细胞中的特异性结合蛋白为eef1a1。6、采用sirna将eef1a1基因敲减后,研究mlif在缺氧条件下对bv2小胶质细胞极化的调控作用。结果显示,sirna转染的bv2小胶质细胞缺氧后m1markers(cd11b、cd32、inos、il-1β、tnf-α)mrna或蛋白的表达较阴性对照组显著升高,m2markers(arg-1、cd206、il-4、il-10)mrna或蛋白的表达较阴性对照组显著降低,而mlif处理后细胞m1markers表达降低、m2markers的表达明显升高,小胶质细胞向m2型极化;在eef1a1敲减后bv2小胶质细胞中mlif对缺氧诱导的小胶质细胞极化分型的调控作用减弱,且mlif对nf-κb通路的抑制作用减弱,提示eef1a1在mlif抑制缺氧诱导的小胶质细胞极化分型中发挥重要的调控作用;同时结果还显示eef1a1敲减后,缺氧诱导小胶质细胞中m1markers表达较缺氧对阴性对照组具有显著的上调作用、m2markers表达较缺氧对阴性对照组具有显著的下调作用,提示eef1a1对缺氧诱导的小胶质细胞极化具有一定的调控作用。结论:1.体内外脑缺血模型中,mlif通过降低激活的小胶质细胞m1markers、升高激活的小胶质细胞M2 markers,调控小胶质细胞向M2型转化从而发挥抗炎作用,进而发挥脑缺血神经保护作用。2.MLIF通过与BV2小胶质细胞内eEF1A1蛋白作用,抑制NF-κB通路从而调控小胶质细胞在缺氧条件下由M1型向M2型转化,发挥抗炎神经保护作用。同时提示eEF1A1可能是调控脑缺血中巨噬细胞/小胶质细胞极化的一个新靶点。