论文部分内容阅读
研究目的: 该研究以MR成像技术作为基因显像的手段,选择酪氨酸酶基因作为报告基因在体外细胞中进行实验,一方面探索MR在评价基因转染方面的作用,另一方面试图寻找一种效果好、使用范围广泛的影像分子探针,为在活体上进行无创伤的基因转染评价积累经验.材料与方法:一.酪氨酸酶基因转染;1.采用CaCl<,2>转化法,将pcDNA3tyr质粒导入大肠杆菌DH5 α菌株,用含氨苄青霉素的LB平板选择阳性菌落.2.挑取抗氨苄青霉素的单菌落,进行摇菌扩增,首先以QIAprep Spin Miniprep进行小量质粒的提取纯化,然后以1﹪琼脂糖凝胶电泳观察DNA质量,紫外分光光度法检测质粒DNA含量,用EcoR I和XbaI双酶切鉴定提取的质粒,再以QIAGEN试剂盒进行中等量质粒提取纯化,在50ml菌液中提取质粒备用.质粒的提取纯化均按试剂盒操作说明进行.3.HEK293细胞在含10﹪胎牛血清、青/链霉素(各100U/ml)的DMEM低糖培养液中培养.每48小时换液一次,每2~3天传代一次.待细胞生长良好,且数量足够后进行转染.4.酪氨酸酶基因转染HEK293细胞采用阳离子脂质体法转染,按Gene-SHUTTLE<40>脂质体转染试剂说明进行基因转染.二.MRI成像; 以10<6>个细胞进行MR扫描,MR检查采用膝关节正交线圈,矩阵243×512,Fov15cm×15cm,层厚1.5mm,层距0.1mm.行T<,1>WI(TR/TE 500ms/17ms)、T<,1>WI/SPIR(TR 500ms,TE 17ms)、T<,2>WI(TR 2000ms,TE 100ms)、T<,2>WI/SPIR(TR 2000ms,TE 100ms)、T<,2>WIFFE(TR 500ms,TE 14ms,Flip angle 25°)、T<,2>WIFLAIR(TR 6000ms,TE 100ms,TI2000ms)、STIR/TSE(TR 1500ms,TE 15ms,TI I60ms)、B-TFE(TR 12ms,TE6.2ms,Flip angle 60°)、3D/FFE/MPR(TR 17ms,TE 9.2ms)、T<,1>FFE(TR 500ms,TE 17ms)扫描.观察MR信号,评价MR序列.并以10<6>个细胞的二分之一、四分之一、八分之一、十六分之一进行MR T<,1>WI扫描(TR 500ms,TE 17ms)、T<,1>WI/SPIR扫描(TR 500ms,TE 17ms),观察MR对少量转染细胞的检测能力.然后培养转染细胞一个月,对转染后细胞的生长情况进行评价.在该评价结束后予MR检查,观察黑色素的变化情况.三.转染细胞的验证;1.以Fontana染色法验证转染细胞是否含黑色素;2.以Trizol提取细胞总RNA后以RT-PCR检测酪氨酸酶基因mRNA,反应条件为94℃变性30sec,48℃退火30sec,72℃延伸60sec,30个循环.3.以2﹪戊二醛固定转染细胞后送电镜检查.结 论:1.以酪氨酸酶基因作为报告基因,利用黑色素来反映基因转染情况的技术方法是可行的;2.MR的敏感度能够检测到体外细胞内合成的黑色素,说明现有影像学方法与分子生物学技术结合来评价体外细胞基因转染的效果是可能的,影像学在基因治疗的评价中可以发挥重要的作用.3.不论是分子生物学技术还是影像学技术均需要进一步地改进,才能真正实现它们在基因转染显像中的临床应用.