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结核病(Tuberculosis,TB)作为一种可治疗和可预防的疾病,仍然导致每年200万到300万人死亡。而BCG保护效果的不稳定(O～8096),HIV/AIDS的蔓延,发展中国家公共卫生基础设施的没落以及耐多药结核分枝杆菌的出现导致结核病的迅速传播。现有的以疫苗接种和药物治疗为基础的TB控制战略也不能够抑制这种疾病尤其是耐药结核分枝杆菌的传播。所以作为全球性健康干预措施,开发更有效的抗结核病疫苗刻不容缓。
最近比较基因组学和生物信息学表明除了RD1,还有11个基因组区域在结核分枝杆菌中保守存在,而在BCG疫苗株中是缺失的,这些缺失区包括了Mycobacterium tuberculosis H37Rv 108个ORFs。最近已经有不少研究证明,RDl区和其他的RD区编码的蛋白具有发展成为疫苗和诊断试剂的潜力。结核分枝杆菌基因组中大约有10％的ORFs编码了PE和PPE家族蛋白,它们是富含甘氨酸且M.tuberculosis特有的蛋白。由于PE/PPE家族蛋白在序列和可能结构上的独特性,推测它们有可能具有比较重要的免疫学意义。尽管这两个大家族蛋白在抗结核分枝杆菌的免疫反应中的作用研究得还不是很清楚,不过现在已经有了一些关于PE/PPE蛋白免疫特性的报道。
本项研究中基于BCG免疫缺陷原因的分析以及应对策略选取了RD区中所有PPE家族蛋白(7个),经过计算机分析以及文献资料综合评价选取了在M.tuberculosis中保守存在,而在BCG中缺失的PPE家族成员——Rv3425,对其应用于抗结核疫苗的潜力进行评价。研究工作主要包括以下几部分:
1.重组Rv3425蛋白免疫特性的研究。用纯化的重组Rv3425蛋白100μg和弗氏不完全佐剂(incomplete freunds adjuvant,IFA)混合,隔周皮下免疫C57BL/6小鼠3次,单独用IFA免疫作为对照,最后1次免疫3周后,分别通过ELISPOT和ELISA方法检测脾细胞分泌IFN-γ的能力,IFN-γ,TNFα,IL-4的分泌量,以及血清中特异性抗体的水平。结果表明经过重组Rv3425蛋白免疫之后,小鼠血清中IgG(H+L)、IgG1、IgG2a抗体水平均有所增强;免疫小鼠脾细胞受到特异性抗原刺激后,有较多的淋巴细胞可以分泌表达IFN-γ,并且Rv3425蛋白免疫组IFN-γ,TNFα的分泌量明显高于IFA免疫对照组,而IL-4在两个免疫组中都没有检测到。由此我们可以初步推论PPE蛋白Rv3425有较好的免疫特性,有可能应用于抗结核疫苗的设计。
2.分泌表达Ag85B和Rv3425融合蛋白的重组BCG菌株的筛选和免疫学特性的研究。BCG是很好的活的疫苗载体,可以诱导较强的细胞免疫和体液免疫反应。将一些重要的结核分枝杆菌抗原基因导入BCG,让BCG大量表达保护性抗原,有望诱导比BCG强大而又持久的免疫保护力。结核分枝杆菌早期培养滤液蛋白中的Ag85B是重要的保护性抗原,广泛应用于新型结核病疫苗研究。本研究选择结核分枝杆菌重要保护性抗原Ag85B以及PPE抗原Rv3425,通过穿梭质粒pMV261重组入BCG,构建了rBCG::Ag85B-Rv3425,该重组BCG是国内外首次报道。
用rBCG::Ag85B-Rv3425和BCG菌株免疫C57BL/6小鼠后,通过分析小鼠脾细胞IFNγ的分泌水平,CD4+、CD8+T细胞所占的比例以及抗体IgG水平、IgG2a/IgG1,比较了重组BCG和BCG的免疫原性。研究结果表明,rBCG::Ag85B-Rv3425免疫的小鼠可以引起较BCG免疫小鼠更多的抗原特异性T细胞分泌IFN-γ。除此之外,rBCG::Ag85B-Rv3425免疫的小鼠体液水平也有明显增强,抗原特异性的IgG亚类分析发现在免疫之后的9周可以诱导出更高的IgG2a反应,暗示该重组疫苗引起的可能是具有保护性的Th1反应,这反过来又会促进保护性因子IFN-γ的分泌,这是抗结核疫苗成功的重要因素。因此我们也可以初步推论该重组疫苗rBCG::Ag85B-Rv3425可能成为抗结核的潜在候选疫苗。
3.重组疫苗rBCG::Ag85B-Rv3425对小鼠动物免疫保护效果的研究。皮下免疫C57BL/6小鼠,剂量为5×106cfu,9周后用结核分枝杆菌毒力标准株H37Rv尾静脉攻击,攻击剂量为1×106cfu。攻击后6周,9周,12周,观察小鼠脾、肺中菌落计数、组织病理变化以及小鼠的存活率和攻毒前后体重的变化。研究结果显示rBCG::Ag85B-Rv3425免疫的小鼠肺部菌落数较BCG免疫组有差异(p＜0.05),抗酸染色显示rBCG::Ag85B-Rv3425免疫的小鼠肺部组织的结核杆菌数较BCG免疫组也少。我们可以看出,与BCG相比,rBCG::Ag85B-Rv3425能够产生相当甚至更好的保护作用。在我们的实验观察时间内,BCG免疫组和rBCG::Ag85B-Rv3425免疫组在小鼠存活率方面没有明显差异,为此我们的重组疫苗小鼠毒力攻击保护实验正在武汉大学三级生物安全动物进行长时间毒力株攻击后观察来区分重组BCG与BCG疫苗的保护效率差异。
综上所述,PPE蛋白Rv3425有应用于抗结核疫苗设计的潜力,并且融合表达结核分枝杆菌重要保护性抗原Ag85B和PPE蛋白Rv3425的重组BcG菌株,是产生抗原特异性的细胞免疫反应和保护反应的一种有效方式,可以作为抗结核的潜在候选疫苗。同时该实验也为建立一个高效的候选疫苗筛选方法提供了一定的实验基础。