电化学发光纳米传感器和非酶扩增荧光检测体系在生物分子检测中的应用

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生物分子的识别和定量检测技术是生命科学、医学、食品分析化学等领域能够得到迅速发展的基础。快速并且高灵敏度的生物分子检测分析技术在疾病早期诊断、医药和基因工程等领域得到了愈来愈广泛的应用。然而传统的分析工具和方法由于在灵敏度、特异性、操作简便性、快捷性等方面存在缺陷,因此难以满足日益发展的生物分子高灵敏检测的需求。  电化学发光(Electrochemiluminescence,ECL)是一种具有极高灵敏度的检测方法,它巧妙地将电化学方法与化学发光有机结合,并利用三联吡啶钉与三丙胺在电极表面发生氧化还原反应从而产生高效、稳定地发光,具有快速、操作简单、灵敏度高、线性范围宽、稳定性好和适用性广等优点,使其在生物化学分析、免疫检测以及科学研究等方面发挥着越来越重要的作用。  纳米技术与生物技术的融合,使纳米生物技术获得了很多重要的进展。金纳米粒子由于良好的生物相容性和无毒副作用,近年来广泛应用于生物分析化学、生物分子标记和检测。Mirkin等人于2002年开发了一种基于纳米金的生物条形码方法,该方法能多次放大信号,极大地提高了检测灵敏度。本课题组以小分子半胱胺为基础结合生物条形码技术发展了一种新型的电化学发光信号放大纳米探针,实现了两个数量级的发光信号增强。  本论文将磁珠电化学发光技术和新型纳米金信号放大探针相结合,发展了一种特异而高灵敏的生物分子检测平台,实现了快速、简单并且高灵敏检测蛋白激酶。蛋白激酶在细胞内的分布遍及核、线粒体、微粒体和胞液,是目前新药研究中热门的分子靶点。蛋白激酶催化其底物磷酸化,磷酸化的底物可以通过锆离子捕捉电化学发光纳米探针,形成杂交物。通过链霉亲和素和生物素的特异性结合,杂交物被磁珠捕捉,然后被富集在未修饰电极表面进行电化学发光检测。磁珠技术的使用,不但使整个过程简单快捷和成本节约,而且起到了富集作用,从而使灵敏度进一步提高。该方法实现了0.005U/mL的检测灵敏度。为了更好地验证该平台的可行性,本文利用该平台实现了汞离子检测,灵敏度达到了50pM的水平,同时有着1000倍的特异性。所有的实验结果都说明了该平台有着广泛适用性和较高的灵敏度,有望用于临床诊断和实际环境监控。  此外,我们提出了一种新型的非酶非标记的荧光检测方法,用于生物分子检测。整个过程不需要任何酶的参与,也不需要任何化学基团的修饰。本方法利用待检测物开启双发央系统,并使其循环利用,进行信号放大。发夹打开以后悬挂的一端会形成G-四聚体结构,此结构能够使被淬灭的荧光基团恢复,因此可以通过最终的荧光强度来定量待测物。
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