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研究背景
多囊卵巢综合征(PCOS)是生育年龄妇女常见的一种的内分泌及代谢异常所致的疾病，以长期无排卵(排卵功能紊乱或丧失)和雄激素过多为特征，常伴有糖尿病、高血脂、心血管疾病。性激素结合球蛋白(SHBG)是由肝脏产生的一种糖蛋白，能特异性地结合及转运性激素，调控血液循环中具有生物活性的性激素的水平。SHBG对雄激素水平具有调节作用，是胰岛素抵抗(IR)、2型糖尿病、糖耐量异常的危险因素。然而目前SHBG在PCOS患者代谢异常的诊断价值仍未明确。代谢组学主要目的是在考察生物体系(细胞、组织等)受到刺激或扰动后，生物体系其代谢产物的变化或随时间规律发生的变化。通过筛选PCOS实验组与对照组的差异代谢物，研究差异代谢物参与的生物过程并揭示其参与的生命活动机制。目前PCOS患者代谢组学研究仍处于起步阶段。
研究目的
第一部分：评估SHBG对PCOS患者IR和代谢综合征(MetS)及其组分的预测价值。
第二部分：通过LC-MS/MS法进行非靶向代谢组分析，评估不同BMI水平的PCOS患者血浆代谢物的差异，并筛选可能的差异代谢物和通路。
研究方法
第一部分：收集2018年11月至2019年8月在汕头大学医学院第一附属医院内分泌科或营养科门诊就诊并诊断为PCOS的患者100例和健康志愿者40例。检测SHBG、性激素六项、血脂和行OGTT及胰岛素释放试验，分析SHBG与血清胰岛素相关性和SHBG预测IR的ROC分析，评估SHBG对PCOS患者IR的预测价值。通过阐述SHBG与MetS各代谢组分的相关性和SHBG预测PCOS合并MetS异常组分数量的ROC分析，评估SHBG对PCOS患者MetS及其组分的预测价值。
第二部分：在第一部分入选的PCOS患者中，选取BMI最低的PCOS患者20例(L-BMI组)，合并代谢异常且BMI最高的PCOS患者20例(H-BMI组)，与年龄相匹配的健康志愿者20例。对PCOS患者和健康对照组的血浆用液相色谱/质谱液质联用(LC-MS/MS)技术进行非靶向代谢组学研究。
研究结果
第一部分
SHBG对PCOS患者IR的预测价值
1.PCOS患者和健康志愿者的一般资料分析
本部分共纳入PCOS患者100例和健康志愿者36例。入组PCOS患者中非超重者49例，平均BMI为20.53±2.121kg/m2，超重/肥胖者51例，平均BMI为28.09±2.821kg/m2，入组PCOS患者总的平均BMI为24.39±4.51kg/m2。入组健康志愿者36例，平均BMI为20.10±1.48kg/m2。
2.SHBG及性激素的比较
在PCOS患者中，超重/肥胖组患者SHBG明显低于非超重组(P<0.001)，超重/肥胖组患者LH、FSH、E2明显高于非超重组(P分别为<0.01、0.018、0.011)。PCOS组患者SHBG明显低于健康志愿者组(P<0.001)，PCOS组患者LH、FSH、E2、TT明显高于健康志愿者组(P为<0.001、0.046、<0.001、<0.001)，PCOS组患者P稍低于健康志愿者组(统计P值为0.011)。
3.OGTT及胰岛素释放试验
结果示非超重组患者G60、G120明显低于超重/肥胖组(P分别0.033、0，021)。非超重组患者I0、I60、I120、AUCINS、AUCInsulin/Glucose、HOMA-IR水平均显著低于超重/肥胖组患者(P分别为<0.001、0.001、0.001<0.001、<0.001、0.002)。
结果示PCOS组患者G0、G60、G120、AUCGLU明显高于健康志愿者组(P均为<0.001)。PCOS组I0、I60、I120、AUCInsulin、AUCInsulin/Glucose、HOMA-IR水平均显著高于健康志愿者组(P均为<0.001)。
4.SHBG与血清胰岛素的相关性
PCOS正常体重组患者SHBG仅与G120呈负相关(r=-0.309,P=0.0031)。超重/肥胖组患者SHBG与I0、I60、I120、AUCInsulin、HOMA-IR呈显著负相关(r分别为-0.464,P=0.001，-0.285，P=0.045，-0.3，P=0.034，-0.316，P=0.026，-0.486，P＜0.001)。在所有PCOS患者中，SHBG与G60、G120、AUCGlucose、I0、I60、I120、AUCInsulin、AUCInsulin/Glucose、HOMA-IR呈显著负相关(r分别为-0.215,P=0.0032；-0.279，P=0.005；-0.232，P=0.002；-0.508，P<0.001；-0.293，P=0.003;-0.367,P<0.001;-0.346,P<0.001;-0.281,P=0.005;-0.519,P＜0.001)。将所有研究者数据纳入分析，SHBG与GLU0、G60、G120、I0、I60、I120、AUCInsulin、AUCInsulin/Glucose、HOMA-IR均呈显著负相关(r分别为-0.301,-0.384，-0.376，-0.377，-0.528，-0.352，-0.454，-0.416，-0.306，-0.542，P均＜0.001)。
5.SHBG预测IR的ROC分析
以HOMA-IR≥2.29作为IR切点时，在超重/肥胖组，正常体重组和所有PCOS患者中，SHBG预测IR的ROC分析曲线下面积分别为0.900，0.744和0.870。以HOMA-IR≥2.50作为IR切点时，在超重/肥胖组，正常体重组和所有PCOS患者中，SHBG预测IR的ROC分析曲线下面积分别为0.926，0.747和0.880。
在超重/肥胖亚组中，当HOMA-IR切点取2.29时，SHBG预测IR最佳切点为37nmol/L，敏感性和特异性分别为95.45%和83.72%；当HOMA-IR切点取2.50时，SHBG预测IR最佳切点为30.2nmol/L，敏感性和特异性分别为97.44%和85.42%。
评估SHBG对PCOS患者MetS及其组分的预测价值
1.PCOS患者和健康志愿者的一般资料分析
本部分主要纳入PCOS患者98例和健康志愿者37例，PCOS患者根据其具有MetS的异常组分数量分成四组：PCOS不合并MetS组分中的任何一项(M0组)，PCOS合并MetS至少一项异常(M1组)，PCOS合并MetS至少两项异常(M2组)，PCOS合并MetS至少三项以上异常，即合并MetS组(Mets组)。
主要代谢指标包括BMI，G0，G120，SBP，DBP，TC，TG，LDL-C均随着PCOS合并的MetS组分数量增加而递增，HDL-C，LH和SHBG则随着PCOS合并的MetS组分数量增加而递减。
2.SHBG与主要代谢指标的相关性
SHBG与SBP呈显著负相关(r=-0.371,p＜0.001)，SHBG与DBP呈显著负相关(r=-0.285,p=0.004)，SHBG与BMI呈显著负相关(r=-0615,p＜0.001),SHBG与TG呈显著负相关(r=-0.431,p＜0.001)，SHBG与HDL-C呈显著正相关(r=-0.629,p＜0.001)，SHBG与G120呈显著负相关(r=-0.337,p＜0.001)。
3.SHBG预测PCOS合并MetS异常组分数量的ROC分析
SHBG用于预测PCOS患者合并至少一个MetS异常组分，至少合并二个MetS异常组分和合并MetS的ROC曲线下面积分别是0.92、0.882和0.944。
SHBG用于预测PCOS患者合并至少一个MetS异常组分的最佳切点是37.0nmol/L，敏感性是87.69%，特异性是83.10%。
SHBG用于预测PCOS患者合并至少合并二个MetS异常组分的最佳切点是26.4nmol/L，敏感性是79.41%，特异性是84.31%。
SHBG用于预测PCOS患者合并MetS的最佳切点是21.3nmol/L，敏感性是100.0%，特异性是85.12%。
第二部分
3.1不同BMI水平PCOS患者和健康志愿者代谢组总体差异分析
3.1.1PCA分析
在两两比较中结果显示，不同BMI水平PCOS患者和健康志愿者PCA分析差异不显著。我们将三组人群同时进行分析，提示高BMI组PCOS患者与健康志愿者相比，总体代谢组存在差异。
3.1.2PLS-DA分析
我们对三组代谢组结果进行PLS-DA分析：在阴阳离子相中两两比较均表明模型未“过拟合”。
3.2不同BMI水平PCOS患者和健康志愿者代谢组差异代谢物的数量及差异大小
3.2.1差异代谢物数量
在阴离子相中，检测代谢总数各比较组均为509种，L-BMIvsCon、H-BMIvsCon、L-BMIvsH-BMI差异代谢物总数分别为39、29和10种，在阳离子相中，检测代谢总数各比较组均为320种，L-BMIvsCon、H-BMIvsCon、L-BMIvsH-BMI差异代谢物总数为21、26和23种。
3.2.2差异代谢物多组比较Venn图分析
阳离子模式：H-BMI.vs.Con的差异代谢数量为75种，L-BMI.vs.H-BMI.的差异代谢数量为35种，L-BMI.vs.Con的差异代谢数量为39种，三者共有差异代谢数量为2种。阴离子模式：H-BMI.vs.Con的差异代谢数量为36种，L-BMI.vs.H-BMI.的差异代谢数量为23种，L-BMI.vs.Con的差异代谢数量为21种，三者共有差异代谢数量为2种。
3.3差异代谢物功能及分类注释
3.3.1KEGG功能注释
在阴离子相中，经KEGG功能注释的差异代谢物数量排在前三类的分别是Globaloverviewmap(38种)脂肪代谢(22种)和消化系统相关(15种)；在阳离子相中，经KEGG功能注释的差异代谢物数量排在前三类的分别是Globaloverviewmap(47种)，脂肪代谢(29种)和消化系统相关(22种)。
3.3.2HMDB分类注释
在阴离相中，差异代谢物经HBDM注释的数量前四位分别是：脂质和类脂质分子(62种)，有机酸及其衍生物(39种)，有机机杂环化合物(13种)，苯类(10种)。在阳离子相中，差异代谢物经HBDM注释的数量前四位分别是：脂质和类脂质分子(55种)，有机酸及其衍生物(35种)，有机机杂环化合物(31种)，苯类(20种)。
3.3.3LIPIDMAPS分类注释
在阴离子相中，经LIPIDMAPS分类注释的差异代谢物数量前三位分别为脂肪酸及衍生物(20种)，黄酮类(5种)和类花生酸类(4种)；在阳离子相中，经LIPIDMAPS分类注释的差异代谢物数量前三位分别为类固醇(9种)，脂肪醇(4种)和原子酯(4种)。3.4差异代谢物KEGG富集分析
PCOS患者高BMI组与健康对照组比较，差异代谢物的KEGG通路主要集中在阳离子相中的5-羟色胺能突触，花生四烯酸代谢、非饱和脂肪酸的生物合成和色氨酸代谢。
PCOS患者低BMI组与健康对照组比较，在阴离子相和阳离子相中差异代谢物的KEGG通路主要集中的代谢通路(Metabolic Pathway)中。
PCOS患者高BMI组和低BMI组比较。差异代谢物的KEGG通路主要集中在阴离子相中的蛋白消化与吸收、胆汁酸代谢和阳离子相中的代谢通路和维生素消化与吸收。
结论
1.SHBG与PCOS患者BMI、SBP、DBP、TG、血糖，胰岛素均呈负相关，与HDL-C呈正相关
2.SHBG可用于PCOS患者的IR预测，尤其超重/肥胖亚组，当HOMA-IR切点取2.29时，SHBG预测IR最佳切点为37nmol/L，敏感性和特异性分别为95.45%和83.72%；当HOMA-IR切点取2.50时，SHBG预测IR最佳切点为30.2nmol/L，敏感性和特异性分别为97.44%和85.42%；
3.SHBG可作为PCOS患者合并MetS的预测指标，最佳切点为21.3nmol/L，敏感性为100.0％，特异性为85.12％；
4.不同BMI水平的PCOS患者与健康志愿者比较，三组人群间非靶向代谢组代谢物总体水平上均存在差异；
5.不同BMI水平的PCOS患者与健康志愿者三组人群差异代谢物主要集中在脂质谱、氨基酸代谢和蛋白质的消化吸收等代谢途径中。
多囊卵巢综合征(PCOS)是生育年龄妇女常见的一种的内分泌及代谢异常所致的疾病，以长期无排卵(排卵功能紊乱或丧失)和雄激素过多为特征，常伴有糖尿病、高血脂、心血管疾病。性激素结合球蛋白(SHBG)是由肝脏产生的一种糖蛋白，能特异性地结合及转运性激素，调控血液循环中具有生物活性的性激素的水平。SHBG对雄激素水平具有调节作用，是胰岛素抵抗(IR)、2型糖尿病、糖耐量异常的危险因素。然而目前SHBG在PCOS患者代谢异常的诊断价值仍未明确。代谢组学主要目的是在考察生物体系(细胞、组织等)受到刺激或扰动后，生物体系其代谢产物的变化或随时间规律发生的变化。通过筛选PCOS实验组与对照组的差异代谢物，研究差异代谢物参与的生物过程并揭示其参与的生命活动机制。目前PCOS患者代谢组学研究仍处于起步阶段。
研究目的
第一部分：评估SHBG对PCOS患者IR和代谢综合征(MetS)及其组分的预测价值。
第二部分：通过LC-MS/MS法进行非靶向代谢组分析，评估不同BMI水平的PCOS患者血浆代谢物的差异，并筛选可能的差异代谢物和通路。
研究方法
第一部分：收集2018年11月至2019年8月在汕头大学医学院第一附属医院内分泌科或营养科门诊就诊并诊断为PCOS的患者100例和健康志愿者40例。检测SHBG、性激素六项、血脂和行OGTT及胰岛素释放试验，分析SHBG与血清胰岛素相关性和SHBG预测IR的ROC分析，评估SHBG对PCOS患者IR的预测价值。通过阐述SHBG与MetS各代谢组分的相关性和SHBG预测PCOS合并MetS异常组分数量的ROC分析，评估SHBG对PCOS患者MetS及其组分的预测价值。
第二部分：在第一部分入选的PCOS患者中，选取BMI最低的PCOS患者20例(L-BMI组)，合并代谢异常且BMI最高的PCOS患者20例(H-BMI组)，与年龄相匹配的健康志愿者20例。对PCOS患者和健康对照组的血浆用液相色谱/质谱液质联用(LC-MS/MS)技术进行非靶向代谢组学研究。
研究结果
第一部分
SHBG对PCOS患者IR的预测价值
1.PCOS患者和健康志愿者的一般资料分析
本部分共纳入PCOS患者100例和健康志愿者36例。入组PCOS患者中非超重者49例，平均BMI为20.53±2.121kg/m2，超重/肥胖者51例，平均BMI为28.09±2.821kg/m2，入组PCOS患者总的平均BMI为24.39±4.51kg/m2。入组健康志愿者36例，平均BMI为20.10±1.48kg/m2。
2.SHBG及性激素的比较
在PCOS患者中，超重/肥胖组患者SHBG明显低于非超重组(P<0.001)，超重/肥胖组患者LH、FSH、E2明显高于非超重组(P分别为<0.01、0.018、0.011)。PCOS组患者SHBG明显低于健康志愿者组(P<0.001)，PCOS组患者LH、FSH、E2、TT明显高于健康志愿者组(P为<0.001、0.046、<0.001、<0.001)，PCOS组患者P稍低于健康志愿者组(统计P值为0.011)。
3.OGTT及胰岛素释放试验
结果示非超重组患者G60、G120明显低于超重/肥胖组(P分别0.033、0，021)。非超重组患者I0、I60、I120、AUCINS、AUCInsulin/Glucose、HOMA-IR水平均显著低于超重/肥胖组患者(P分别为<0.001、0.001、0.001<0.001、<0.001、0.002)。
结果示PCOS组患者G0、G60、G120、AUCGLU明显高于健康志愿者组(P均为<0.001)。PCOS组I0、I60、I120、AUCInsulin、AUCInsulin/Glucose、HOMA-IR水平均显著高于健康志愿者组(P均为<0.001)。
4.SHBG与血清胰岛素的相关性
PCOS正常体重组患者SHBG仅与G120呈负相关(r=-0.309,P=0.0031)。超重/肥胖组患者SHBG与I0、I60、I120、AUCInsulin、HOMA-IR呈显著负相关(r分别为-0.464,P=0.001，-0.285，P=0.045，-0.3，P=0.034，-0.316，P=0.026，-0.486，P＜0.001)。在所有PCOS患者中，SHBG与G60、G120、AUCGlucose、I0、I60、I120、AUCInsulin、AUCInsulin/Glucose、HOMA-IR呈显著负相关(r分别为-0.215,P=0.0032；-0.279，P=0.005；-0.232，P=0.002；-0.508，P<0.001；-0.293，P=0.003;-0.367,P<0.001;-0.346,P<0.001;-0.281,P=0.005;-0.519,P＜0.001)。将所有研究者数据纳入分析，SHBG与GLU0、G60、G120、I0、I60、I120、AUCInsulin、AUCInsulin/Glucose、HOMA-IR均呈显著负相关(r分别为-0.301,-0.384，-0.376，-0.377，-0.528，-0.352，-0.454，-0.416，-0.306，-0.542，P均＜0.001)。
5.SHBG预测IR的ROC分析
以HOMA-IR≥2.29作为IR切点时，在超重/肥胖组，正常体重组和所有PCOS患者中，SHBG预测IR的ROC分析曲线下面积分别为0.900，0.744和0.870。以HOMA-IR≥2.50作为IR切点时，在超重/肥胖组，正常体重组和所有PCOS患者中，SHBG预测IR的ROC分析曲线下面积分别为0.926，0.747和0.880。
在超重/肥胖亚组中，当HOMA-IR切点取2.29时，SHBG预测IR最佳切点为37nmol/L，敏感性和特异性分别为95.45%和83.72%；当HOMA-IR切点取2.50时，SHBG预测IR最佳切点为30.2nmol/L，敏感性和特异性分别为97.44%和85.42%。
评估SHBG对PCOS患者MetS及其组分的预测价值
1.PCOS患者和健康志愿者的一般资料分析
本部分主要纳入PCOS患者98例和健康志愿者37例，PCOS患者根据其具有MetS的异常组分数量分成四组：PCOS不合并MetS组分中的任何一项(M0组)，PCOS合并MetS至少一项异常(M1组)，PCOS合并MetS至少两项异常(M2组)，PCOS合并MetS至少三项以上异常，即合并MetS组(Mets组)。
主要代谢指标包括BMI，G0，G120，SBP，DBP，TC，TG，LDL-C均随着PCOS合并的MetS组分数量增加而递增，HDL-C，LH和SHBG则随着PCOS合并的MetS组分数量增加而递减。
2.SHBG与主要代谢指标的相关性
SHBG与SBP呈显著负相关(r=-0.371,p＜0.001)，SHBG与DBP呈显著负相关(r=-0.285,p=0.004)，SHBG与BMI呈显著负相关(r=-0615,p＜0.001),SHBG与TG呈显著负相关(r=-0.431,p＜0.001)，SHBG与HDL-C呈显著正相关(r=-0.629,p＜0.001)，SHBG与G120呈显著负相关(r=-0.337,p＜0.001)。
3.SHBG预测PCOS合并MetS异常组分数量的ROC分析
SHBG用于预测PCOS患者合并至少一个MetS异常组分，至少合并二个MetS异常组分和合并MetS的ROC曲线下面积分别是0.92、0.882和0.944。
SHBG用于预测PCOS患者合并至少一个MetS异常组分的最佳切点是37.0nmol/L，敏感性是87.69%，特异性是83.10%。
SHBG用于预测PCOS患者合并至少合并二个MetS异常组分的最佳切点是26.4nmol/L，敏感性是79.41%，特异性是84.31%。
SHBG用于预测PCOS患者合并MetS的最佳切点是21.3nmol/L，敏感性是100.0%，特异性是85.12%。
第二部分
3.1不同BMI水平PCOS患者和健康志愿者代谢组总体差异分析
3.1.1PCA分析
在两两比较中结果显示，不同BMI水平PCOS患者和健康志愿者PCA分析差异不显著。我们将三组人群同时进行分析，提示高BMI组PCOS患者与健康志愿者相比，总体代谢组存在差异。
3.1.2PLS-DA分析
我们对三组代谢组结果进行PLS-DA分析：在阴阳离子相中两两比较均表明模型未“过拟合”。
3.2不同BMI水平PCOS患者和健康志愿者代谢组差异代谢物的数量及差异大小
3.2.1差异代谢物数量
在阴离子相中，检测代谢总数各比较组均为509种，L-BMIvsCon、H-BMIvsCon、L-BMIvsH-BMI差异代谢物总数分别为39、29和10种，在阳离子相中，检测代谢总数各比较组均为320种，L-BMIvsCon、H-BMIvsCon、L-BMIvsH-BMI差异代谢物总数为21、26和23种。
3.2.2差异代谢物多组比较Venn图分析
阳离子模式：H-BMI.vs.Con的差异代谢数量为75种，L-BMI.vs.H-BMI.的差异代谢数量为35种，L-BMI.vs.Con的差异代谢数量为39种，三者共有差异代谢数量为2种。阴离子模式：H-BMI.vs.Con的差异代谢数量为36种，L-BMI.vs.H-BMI.的差异代谢数量为23种，L-BMI.vs.Con的差异代谢数量为21种，三者共有差异代谢数量为2种。
3.3差异代谢物功能及分类注释
3.3.1KEGG功能注释
在阴离子相中，经KEGG功能注释的差异代谢物数量排在前三类的分别是Globaloverviewmap(38种)脂肪代谢(22种)和消化系统相关(15种)；在阳离子相中，经KEGG功能注释的差异代谢物数量排在前三类的分别是Globaloverviewmap(47种)，脂肪代谢(29种)和消化系统相关(22种)。
3.3.2HMDB分类注释
在阴离相中，差异代谢物经HBDM注释的数量前四位分别是：脂质和类脂质分子(62种)，有机酸及其衍生物(39种)，有机机杂环化合物(13种)，苯类(10种)。在阳离子相中，差异代谢物经HBDM注释的数量前四位分别是：脂质和类脂质分子(55种)，有机酸及其衍生物(35种)，有机机杂环化合物(31种)，苯类(20种)。
3.3.3LIPIDMAPS分类注释
在阴离子相中，经LIPIDMAPS分类注释的差异代谢物数量前三位分别为脂肪酸及衍生物(20种)，黄酮类(5种)和类花生酸类(4种)；在阳离子相中，经LIPIDMAPS分类注释的差异代谢物数量前三位分别为类固醇(9种)，脂肪醇(4种)和原子酯(4种)。3.4差异代谢物KEGG富集分析
PCOS患者高BMI组与健康对照组比较，差异代谢物的KEGG通路主要集中在阳离子相中的5-羟色胺能突触，花生四烯酸代谢、非饱和脂肪酸的生物合成和色氨酸代谢。
PCOS患者低BMI组与健康对照组比较，在阴离子相和阳离子相中差异代谢物的KEGG通路主要集中的代谢通路(Metabolic Pathway)中。
PCOS患者高BMI组和低BMI组比较。差异代谢物的KEGG通路主要集中在阴离子相中的蛋白消化与吸收、胆汁酸代谢和阳离子相中的代谢通路和维生素消化与吸收。
结论
1.SHBG与PCOS患者BMI、SBP、DBP、TG、血糖，胰岛素均呈负相关，与HDL-C呈正相关
2.SHBG可用于PCOS患者的IR预测，尤其超重/肥胖亚组，当HOMA-IR切点取2.29时，SHBG预测IR最佳切点为37nmol/L，敏感性和特异性分别为95.45%和83.72%；当HOMA-IR切点取2.50时，SHBG预测IR最佳切点为30.2nmol/L，敏感性和特异性分别为97.44%和85.42%；
3.SHBG可作为PCOS患者合并MetS的预测指标，最佳切点为21.3nmol/L，敏感性为100.0％，特异性为85.12％；
4.不同BMI水平的PCOS患者与健康志愿者比较，三组人群间非靶向代谢组代谢物总体水平上均存在差异；
5.不同BMI水平的PCOS患者与健康志愿者三组人群差异代谢物主要集中在脂质谱、氨基酸代谢和蛋白质的消化吸收等代谢途径中。