氧化苦参碱等八种中药成分对CCNE1表达高的卵巢癌治疗研究

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目前三大妇科癌症有宫颈癌,子宫癌,卵巢癌。而卵巢恶性肿瘤是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一,发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第三位,由于卵巢癌的早期诊断的方法尚不够完善,治疗的规律还没有被完全掌握,卵巢上皮癌死亡率却占各类妇科肿瘤的首位,是对妇女生命造成严重威胁的妇女恶性肿瘤之一,国内外对此都非常重视。国外目前对于卵巢癌的治疗主要有化疗,手术等,因而存在很高的复发率和毒副作用。而本课题根据已知卵巢癌病人中15%-20%基因组织中带有CCNE1(cyclinE1)基因扩增,欲观察在卵巢癌cell中是否有同样情况,是否能利用已知的卵巢CNA(copy Number abnormally)来设计一个有效的方法来达到治疗卵巢癌的目的。在我国,中药资源丰富,中药在治疗癌症方面亦取得很好的疗效,最后欲观察能否用中药有效成分达到同样的治疗效果。  目的:探讨利用已知的卵巢CNA(copy Number abnormally)来设计一个有效的方法来达到治疗卵巢癌的可行性,以及是否有中药有类似功效的。  方法:①Western blot实验验证12种卵巢癌和卵巢上皮细胞的CCNE1(cyclinE1)表达。②RT-PCR方法观察12种卵巢癌在mRNA水平上CCNE1的表达。③Genomic DNA实验观察卵巢癌细胞中CCNE1 gene copy number。④Si-RNA检测CCNE1的存在对有CCNE1表达的卵巢癌细胞的生存有没有影响,影响是否重大。观察Si-RNA对相关CCNE1表达的卵巢癌细胞的抑制率,首先Westernblot检测CCNE1表达高的卵巢癌沉没后结果,然后检测在加si-RNA后,卵巢癌细胞抑制率与CCNE1蛋白表达的关系。⑤通过观察与CCNE1相关的信号通路图,我们观察到与CCNE1比较相近的CDK2,我们试用已经有的inhibitorCDK2,inhibitor CDK4,inhibitor CDK1通过MTS实验观察与CCNE1相关的卵巢癌细胞通过加入抑制剂后的敏感度。⑥流式实验通过加Inhibitor CDK2观察与CCNE1相关的卵巢癌细胞的死亡情况。⑦动物实验购买裸鼠,注入卵巢癌种瘤,致瘤成功后加入抑制剂观察裸鼠成活时间与未注入抑制剂的裸鼠成活时间对比。⑧通过查阅文献寻找与inhibitor CDK2相关的中药有效成分有人参皂苷Rh2,小檗碱,R型人参皂苷Rh2,盐酸去氢骆驼蓬碱,淫羊藿素,氧化苦参碱,骆驼蓬碱,吉马酮,通过MTT,western blot实验检测在加入这些中药后CCNE1是否能够下降。  结果:①Western blot实验验证12种卵巢癌和卵巢上皮细胞CCNE1表达高的细胞,在mRNA水平上CCNE1的表达和CCNE1 gene copy number也比较高。②Si-RNA检测CCNE1的存在对有CCNE1表达的卵巢癌细胞的生存有较大影响。观察Si-RNA对相关CCNE1表达的卵巢癌细胞的抑制率,首先Western blot检测CCNE1表达高的卵巢癌沉没后结果,发现沉没效果良好,在卵巢癌细胞中,通过加过SI-RNA敲掉基因后,CCNE1蛋白表达高的细胞抑制率高,而CCNE1蛋白表达低的细胞抑制率大多比较低。③而通过细胞信号图我们找到的InhibitorCDK1在加入后,能够杀死所有的细胞,不具有意义。④CCNE1表达高的卵巢癌细胞在加入CDK2抑制剂后Ic50比较低,相对比较敏感。CCNE1表达低或者无表达的卵巢癌细胞在加入CDK2抑制剂后Ic50比较高,相对比较不敏感。⑤在流式实验中,我们观察到,CCNE1蛋白表达较弱的卵巢癌细胞在加入inhibitorCDK2后,细胞有死亡或晚期凋亡;CCNE1蛋白无表达的卵巢癌细胞在加入inhibitor CDK2后,细胞有极少的死亡或晚期凋亡。⑥动物实验中我们发现通过加入inhibitor CDK2后对于致瘤成功的裸鼠有很好的抑制作用,有效的延长了卵巢癌裸鼠的寿命。⑦通过筛选与inhibitor CDK2相关的中药单体,我们也发现了盐酸去氢骆驼蓬碱可能能够起到与inhibitor CDK2相似的功效。因此,此实验验证了我们的猜想,即inhibitor CDK2对于CCNE1表达高的卵巢癌有很好的作用,同时我们可能找到相似的中药对于CCNE1表达高的卵巢癌有同样的效果。  结论:①inhibitor CDK2对于CCNE1表达高的卵巢癌有很好的疗效。②中药单体盐酸去氢骆驼蓬碱可能能够起到与inhibitor CDK2相似的功效。
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