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日本沼虾，俗称河虾，是中国重要的渔业资源，也是高蛋白低脂肪的优质水产食品，但其体内的主要过敏原能够引起严重的过敏反应。已有研究表明，原肌球蛋白(TM)是日本沼虾的主要过敏原之一，通常能引起甲壳类动物之间以及甲壳类与其它无脊椎动物之间的免疫交叉反应。然而，针对日本沼虾过敏原的抗原表位、免疫交叉反应以及消化稳定性的研究鲜有报道，尚待研究。
因此，本文通过生物信息学技术预测日本沼虾原肌球蛋白的抗原表位，并对其免疫交叉反应性进行预测，同时用免疫印迹(Westernblotting，WB)和间接竞争酶联免疫吸附测定(icELISA)实验验证日本沼虾与斑节对虾、中国对虾以及刀额新对虾的免疫交叉反应性，通过体外静态模拟胃肠道消化评价日本沼虾原肌球蛋白的消化稳定性。研究的主要方法、结果及结论如下：
1、采用热处理、硫酸铵分段沉淀法与阴离子交换层析法分离纯化日本沼虾、斑节对虾、中国对虾以及刀额新对虾的原肌球蛋白，并利用SDS-PAGE进行分析鉴定。结果表明，纯化出的原肌球蛋白纯度达85%以上，适合进行后续实验。
2、通过DNAStar软件、SOPMA、BepiPred1.0Server及ABCpred在线网站预测日本沼虾原肌球蛋白的B细胞线性表位，应用SYFPEITHI、NetMHCII2.3Server与NetMHCIIpan3.2Server预测T细胞表位。综合分析以上预测结果，表明日本沼虾原肌球蛋白可能的B细胞线性表位有21RADTLEQQNKEANN34、37EKTEEEIRTTQKKMQQ52、71LEEKEKA77、99LERSEERLN107、119AADESER125、134SLSDEER140、158ADRKYDE164、177ERAEERAETG186、210SEEKANQREEAYKE223、262NEKEKYK268，可能的T细胞表位有82EGEVAALNRRIQLL95、105RLNTATTKLAEAS117、165VARKLAMVEADLE177、195EELRVVGNNLKSLE208、222KEQIKTLTNKLKAA235。通过与其它种类甲壳类已知表位对比，结果表明日本沼虾与其它虾蟹可能会发生免疫交叉反应。
3、采用Westernblotting和icELISA实验，分别以兔抗日本沼虾原肌球蛋白血清及虾类过敏患者血清为一抗，检测斑节对虾、中国对虾以及刀额新对虾的原肌球蛋白对日本沼虾原肌球蛋白的反应程度与不同浓度的竞争抑制率。结果表明，三种对虾均能与兔抗血清及患者血清反应，证实了日本沼虾原肌球蛋白与斑节对虾、中国对虾、刀额新对虾原肌球蛋白之间存在免疫交叉反应，并且随着竞争抗原浓度的增加，抑制作用也增强。与IgG抗体反应时，斑节对虾、刀额新对虾、中国对虾与日本沼虾的免疫交叉反应率分别为59.6%、37.7%、23.5%；与IgE抗体反应时，免疫交叉反应率分别为90.4%、69.6%、38.7%。
4、体外静态模拟婴幼儿及成人消化液消化日本沼虾原肌球蛋白，通过测定水解度和多肽浓度，Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定，RP-HPLC与MALDI-TOF-MS分析，多角度评价原肌球蛋白的消化稳定性。日本沼虾TM的水解度和多肽浓度都随体外模拟消化时间延长而升高。经模拟成人、婴幼儿胃消化和肠消化后，它们的水解度分别为17.99±1.41％、49.46±1.02％和9.92±1.50％、30.68±1.04％，酸溶性肽浓度则分别为74.77±6.84μg/mL、303.99±12μg/mL和46.39±7.5μg/mL、175.93±11.53μg/mL。体外模拟胃-肠-BBM酶消化实验表明，日本沼虾原肌球蛋白比较耐婴幼儿消化、易被成人消化。成人胃、肠消化后的消化片段主要集中分布于15-30kDa、20kDa以下。婴幼儿胃消化后的消化片段较少，其肠消化后的消化片段则分布广泛。
因此，本文通过生物信息学技术预测日本沼虾原肌球蛋白的抗原表位，并对其免疫交叉反应性进行预测，同时用免疫印迹(Westernblotting，WB)和间接竞争酶联免疫吸附测定(icELISA)实验验证日本沼虾与斑节对虾、中国对虾以及刀额新对虾的免疫交叉反应性，通过体外静态模拟胃肠道消化评价日本沼虾原肌球蛋白的消化稳定性。研究的主要方法、结果及结论如下：
1、采用热处理、硫酸铵分段沉淀法与阴离子交换层析法分离纯化日本沼虾、斑节对虾、中国对虾以及刀额新对虾的原肌球蛋白，并利用SDS-PAGE进行分析鉴定。结果表明，纯化出的原肌球蛋白纯度达85%以上，适合进行后续实验。
2、通过DNAStar软件、SOPMA、BepiPred1.0Server及ABCpred在线网站预测日本沼虾原肌球蛋白的B细胞线性表位，应用SYFPEITHI、NetMHCII2.3Server与NetMHCIIpan3.2Server预测T细胞表位。综合分析以上预测结果，表明日本沼虾原肌球蛋白可能的B细胞线性表位有21RADTLEQQNKEANN34、37EKTEEEIRTTQKKMQQ52、71LEEKEKA77、99LERSEERLN107、119AADESER125、134SLSDEER140、158ADRKYDE164、177ERAEERAETG186、210SEEKANQREEAYKE223、262NEKEKYK268，可能的T细胞表位有82EGEVAALNRRIQLL95、105RLNTATTKLAEAS117、165VARKLAMVEADLE177、195EELRVVGNNLKSLE208、222KEQIKTLTNKLKAA235。通过与其它种类甲壳类已知表位对比，结果表明日本沼虾与其它虾蟹可能会发生免疫交叉反应。
3、采用Westernblotting和icELISA实验，分别以兔抗日本沼虾原肌球蛋白血清及虾类过敏患者血清为一抗，检测斑节对虾、中国对虾以及刀额新对虾的原肌球蛋白对日本沼虾原肌球蛋白的反应程度与不同浓度的竞争抑制率。结果表明，三种对虾均能与兔抗血清及患者血清反应，证实了日本沼虾原肌球蛋白与斑节对虾、中国对虾、刀额新对虾原肌球蛋白之间存在免疫交叉反应，并且随着竞争抗原浓度的增加，抑制作用也增强。与IgG抗体反应时，斑节对虾、刀额新对虾、中国对虾与日本沼虾的免疫交叉反应率分别为59.6%、37.7%、23.5%；与IgE抗体反应时，免疫交叉反应率分别为90.4%、69.6%、38.7%。
4、体外静态模拟婴幼儿及成人消化液消化日本沼虾原肌球蛋白，通过测定水解度和多肽浓度，Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定，RP-HPLC与MALDI-TOF-MS分析，多角度评价原肌球蛋白的消化稳定性。日本沼虾TM的水解度和多肽浓度都随体外模拟消化时间延长而升高。经模拟成人、婴幼儿胃消化和肠消化后，它们的水解度分别为17.99±1.41％、49.46±1.02％和9.92±1.50％、30.68±1.04％，酸溶性肽浓度则分别为74.77±6.84μg/mL、303.99±12μg/mL和46.39±7.5μg/mL、175.93±11.53μg/mL。体外模拟胃-肠-BBM酶消化实验表明，日本沼虾原肌球蛋白比较耐婴幼儿消化、易被成人消化。成人胃、肠消化后的消化片段主要集中分布于15-30kDa、20kDa以下。婴幼儿胃消化后的消化片段较少，其肠消化后的消化片段则分布广泛。